참고: 버퍼는 0.22μm 필터를 사용하여 필터링하고 1시간 동안 진공 상태에서 탈기해야 합니다.
1. 지질 소포 준비
- 2mL 유리관을 사용합니다. 각 지질, 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(POPC), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포-L-세린(POPS) 및 콜레스테롤(Chol)을 클로로포름/메탄올(50:50 v/v)의 혼합물에 용해시켜 투명한 5mM 지질 용액을 준비합니다. 클로로포름 / 메탄올 / 물 (20 : 9 : 1 v / v)의 혼합물에 1,2- 디올레올올 -sn- 글리세로 -3- 포스포 - (1'- myo-inositol-4', 5'- 비스 포스페이트) (PI (4,5) P2)를 용해시킵니다.
- 10mL 유리관에서 POPC/POPS(80/20), POPC/PI(4,5)P2(95/5), POPC/POPS/Chol(60/20/20), POPC/POPS/PI(4,5)P2/Chol(60/17/3/20) 및 POPC/DOPC/POPS/PI(4,5)P2/Chol(37/20/20/3/20)(표 1)의 원하는 몰 비율로 용해된 지질을 결합합니다.
메모: 총 지질의 최종 양은 500μg입니다.
- 건조한 질소 흐름을 사용하여 유기 용매를 증발시킵니다. 지질 혼합물을 고진공(동결 건조) 시스템에 3시간 동안 그대로 두어 용매의 잔류 흔적을 제거합니다.
메모: 그 결과 드라이 클리어 필름이 생성됩니다.
- 1mL의 구연산염 완충액(10mM 트리소듐-구연산염, 150mM NaCl, pH 4.6)에 지질 필름을 재현탁합니다. 수조에서 30분 동안 60°C(이 온도는 혼합물에서 가장 많이 녹는 지질의 상전이 온도보다 약 10°C 높음)에서 지질 현탁액을 배양하고 5분마다 격렬하게 소용돌이칩니다.
메모: 그 결과 큰 다층 소포(MLV)가 형성됩니다. 현탁액을 전이 온도 이상으로 유지하십시오.
- 50nm 직경의 공극 크기 폴리카보네이트 멤브레인이 장착된 압출기(이 경우 60°C)를 전이 온도(여기서는 40 - 50°C) 이상으로 30분 동안 예열합니다.
- MLV 현탁액을 예열된 압출기에 로드하고 혼합물을 폴리카보네이트 멤브레인을 통해 31x를 부드럽게 통과시켜 작은 단층 소포(SUV)를 형성합니다. 전이 온도보다 높은 온도를 유지하십시오.
- SUV 현탁액을 2mL 플라스틱 반응 용기로 옮기고 시트레이트 완충액을 추가하여(단계 1.4 참조) 최종 부피를 2mL.
로 만듭니다.
메모: 이를 통해 최종 지질 농도는 250μg/mL가 됩니다.
2. 석영 센서 취급
참고: 석영 센서는 항상 핀셋으로 다루십시오.
- 폴리테트라플루오로에틸렌 홀더에 삽입된 4개의 센서를 2% SDS 용액에 ≥ 30분 동안 배양합니다. 초순수로 광범위하게 세척하여 SDS를 완전히 제거하고 건조 아르곤 또는 질소 흐름을 사용하여 건조시킵니다.
- 플라즈마 세척 시스템을 사용하여 오염 물질을 완전히 제거하십시오. 건조 센서를 플라즈마 세척실에 삽입하고 챔버를 비우고 산소로 3배 플러시합니다. 플라즈마 클리너를 켭니다. 다음 공정 매개변수를 사용하십시오: 1 x 10-4 Torr 압력, 높은 무선 주파수(RF) 출력 및 10분의 공정 시간. 기계를 끄고 센서를 꺼냅니다.
3. 마이크로 밸런스 작동
참고: 연동 펌프에 연결되고 80 μL/min의 유속으로 설정된 병렬 구성의 4개의 온도 제어 유량 챔버가 있는 마이크로 저울 시스템이 사용되었습니다. 개방 흐름 모드에서 버퍼는 피더 저장소에서 수용 탱크로 펌핑되었습니다. 루프 모드에서 수용 탱크는 폐쇄 루프를 생성하기 위해 피더 저장소에 연결되었습니다. 온도는 20°C로 설정했습니다.
- 핀셋을 사용하여 플라즈마 세척 센서를 4개의 플로우 챔버에 조심스럽게 도킹합니다. 누출을 유발할 수 있는 챔버와 튜브에 압력이 가해지거나 비틀리지 않도록 하십시오.
- 구연산염 완충액(10mM 트리소듐-구연산염, 150mM NaCl, pH 4.6)으로 10분 동안 시스템을 플러시합니다.
메모: 이를 위해서는 정확히 3.2mL의 완충액이 필요하지만 초과 완충액(10mL)을 사용하는 것이 좋습니다.
- 프로그램을 시작합니다. 주파수 및 소산 기준선이 안정될 때까지(약 40 - 60분 소요) 소프트웨어를 사용하여 첫 번째 기본 톤(n = 1st) 및 배음(n = 3rd - 13th)의 주파수 및 소산의 변경 사항을 기록하기 시작합니다.
메모: 주파수 노이즈 레벨(피크 투 피크)은 0.5Hz보다 낮아야 하며, 손실의 경우 0.1·10-6보다 낮아야 하며, 주파수에서 1Hz/h, 손실에서 0.3·10-6/h의 최대 드리프트(수용액에서)를 가져야 합니다.
- 기준선이 안정되면 SUV 현탁액을 구연산염 완충액(작은 튜브에 2mL)에 적용합니다. 반응 용기를 사용하여 1.5mL의 데드 볼륨을 제거합니다. 그런 다음 루프 흐름 모드에서 시스템을 닫습니다. 주파수/소산 이동을 10분 더 기록합니다.
메모: 이 기간 동안 소포는 SiO2 표면으로 퍼지고 융합하여 연속적인 이중층을 형성합니다(그림 1, 그림 2 및 그림 3의 2단계). 센서 표면의 SUV 흡착은 2위상이며 소산에서 일반적인 주파수 최소 및 최대를 갖습니다. 26 - 29Hz(표 1 참조)에서 특징적인 주파수 이동(지질 조성에 따라 다름)을 갖는 안정적인 새로운 주파수/소산 기준선은 표면의 연속적인 이중층을 나타냅니다.
- SLB가 안정되면(3.4단계 참조) 40분 동안 개방 흐름 모드에서 필요한 Ca2+ 농도(실험에 따라 50μM에서 최대 1mM CaCl2 범위)에서 실행 중인 버퍼(10mM HEPES, 150mM NaCl, pH 7.4)로 시스템을 평형화합니다.
- 단백질(여기서는 AnxA2)을 Ca2+를 포함하는 실행 중인 버퍼에 추가합니다(3.5단계 참조). 평형 정상 상태에 도달할 때까지 루프 흐름 모드에서 단백질 적용을 수행합니다(그림 1, 그림 2 및 그림 3의 3단계).
메모: 단백질 농도는 1 내지 400 nM 범위일 수 있습니다. 단백질 흡착은 질량(단백질) 흡착을 반영하는 농도 의존적 주파수 이동을 초래합니다.
- 개방형 흐름 모드에서 실행 버퍼에서 Ca2+ 이온을 5mM EGTA로 킬레이트화하여 결합된 단백질을 해리합니다(그림 1 및 그림 2의 4단계).
메모: 빈도의 회복과 SLB 기준선으로의 소멸은 단백질 결합의 총 가역성을 나타냅니다. 연관-해리 주기를 반복하여 다른 농도 또는 단백질을 비교할 수 있습니다.
