$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. DNA 커튼의 EWS-FLI1 응축 형성 이미징
- 이미징 소프트웨어를 열고 명시야 아래에서 3 × 3 지그재그 패턴의 위치를 찾아 표시합니다.
- 0.2mL/분의 속도로 흐름을 켜서 10분 동안 이중 가닥 DNA 염료로 DNA를 염색합니다.
- 이미징 버퍼로 mCherry-EWS-FLI1을 튜브의 100μL 중 100nM 농도로 희석합니다.
- 100μL 유리 주사기로 단백질 시료를 밸브를 통해 로드하고 유속을 0.4mL/분으로 변경합니다.
- 488nm 레이저를 켜고 각 영역을 사전 스캔하여 DNA 분포 상태를 확인하고 DNA 분자가 고르게 분포하는 영역을 선택합니다. 레이저 출력을 488nm 레이저의 경우 10%로, 561nm 레이저의 경우 20%로 설정합니다. 파워 미터를 사용하여 프리즘 근처의 실제 레이저 출력을 측정합니다(488nm 레이저의 경우 4.5mW, 561nm 레이저의 경우 16.0mW).
- 이미지 획득
- 488nm 및 561nm 레이저를 동시에 사용하여 2초 간격으로 이미지를 획득하기 시작합니다.
- 밸브를 수동에서 주입 모드로 변경하여 이미징 버퍼가 단백질 샘플을 플로우 셀로 플러시하도록 합니다.
메모: 이 과정은 ~30초가 소요되며, EWS-FLI1 단백질이 플로우 셀에 도달하는 즉시 시야가 mCherry 신호로 덮일 것입니다.
- free EWS-FLI1을 제거하려면 561nm 레이저만 켠 상태에서 이미징 버퍼로 플로우셀을 5분 동안 계속 세척합니다. 흐름을 멈추고 37°C에서 10분 동안 배양합니다.
- 0.4mL/분의 속도로 흐름을 켜서 DNA가 확장되도록 하고, 서로 다른 프레임 사이에 2초 간격으로 이미지를 획득하여 EWS-FLI1 응축수 형성의 고처리량 데이터를 얻습니다.
2. mCherry-EWS-FLI1에 대한 강도 분석
- 데이터를 이미지 시퀀스로 ImageJ 소프트웨어로 가져오고, 8×8픽셀 정사각형의 25× GGAA 사이트에서 반점을 선택하고, 이미지를 .tif 형식으로 저장합니다.
- 전체 반점을 포함하여 8×8픽셀 정사각형의 강도의 합계로 강도를 계산하고 8x8 픽셀 정사각형 근처에 있는 동일한 크기의 영역에서 배경의 강도를 빼서 배경을 제거합니다.