DNA 커튼에서 융합 단백질 응축물 어셈블리를 시각화하기 위한 단일 분자 이미징

초록

출처: Zuo, L. et al., DNA에 조립되는 EWS-FLI1 응축수의 단일 분자 이미징. J. Vis. 특급. (2021년)

이 비디오는 단일 분자 이미징을 사용하여 특정 유전자 자리에서 DNA 분자의 융합 단백질 응축물 어셈블리를 시각화하는 방법을 설명합니다. 이러한 응축물은 LCD-LCD 및 LCD-DBD 상호 작용으로 인해 형성되며, 이를 통해 RNA 중합효소 II를 동원하고 유전자 전사를 향상시킬

수 있습니다.

프로토콜

1. DNA 커튼의 EWS-FLI1 응축 형성 이미징

1. 이미징 소프트웨어를 열고 명시야 아래에서 3 × 3 지그재그 패턴의 위치를 찾아 표시합니다.
2. 0.2mL/분의 속도로 흐름을 켜서 10분 동안 이중 가닥 DNA 염료로 DNA를 염색합니다.
3. 이미징 버퍼로 mCherry-EWS-FLI1을 튜브의 100μL 중 100nM 농도로 희석합니다.
4. 100μL 유리 주사기로 단백질 시료를 밸브를 통해 로드하고 유속을 0.4mL/분으로 변경합니다.
5. 488nm 레이저를 켜고 각 영역을 사전 스캔하여 DNA 분포 상태를 확인하고 DNA 분자가 고르게 분포하는 영역을 선택합니다. 레이저 출력을 488nm 레이저의 경우 10%로, 561nm 레이저의 경우 20%로 설정합니다. 파워 미터를 사용하여 프리즘 근처의 실제 레이저 출력을 측정합니다(488nm 레이저의 경우 4.5mW, 561nm 레이저의 경우 16.0mW).
6. 이미지 획득
   1. 488nm 및 561nm 레이저를 동시에 사용하여 2초 간격으로 이미지를 획득하기 시작합니다.
   2. 밸브를 수동에서 주입 모드로 변경하여 이미징 버퍼가 단백질 샘플을 플로우 셀로 플러시하도록 합니다.
      메모: 이 과정은 ~30초가 소요되며, EWS-FLI1 단백질이 플로우 셀에 도달하는 즉시 시야가 mCherry 신호로 덮일 것입니다.
   3. free EWS-FLI1을 제거하려면 561nm 레이저만 켠 상태에서 이미징 버퍼로 플로우셀을 5분 동안 계속 세척합니다. 흐름을 멈추고 37°C에서 10분 동안 배양합니다.
   4. 0.4mL/분의 속도로 흐름을 켜서 DNA가 확장되도록 하고, 서로 다른 프레임 사이에 2초 간격으로 이미지를 획득하여 EWS-FLI1 응축수 형성의 고처리량 데이터를 얻습니다.

2. mCherry-EWS-FLI1에 대한 강도 분석

1. 데이터를 이미지 시퀀스로 ImageJ 소프트웨어로 가져오고, 8×8픽셀 정사각형의 25× GGAA 사이트에서 반점을 선택하고, 이미지를 .tif 형식으로 저장합니다.
2. 전체 반점을 포함하여 8×8픽셀 정사각형의 강도의 합계로 강도를 계산하고 8x8 픽셀 정사각형 근처에 있는 동일한 크기의 영역에서 배경의 강도를 빼서 배경을 제거합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
488nm 다이오드 펌핑 고체 레이저	간섭성의	OBIS488LS
561nm 다이오드 펌핑 고체 레이저	간섭성의	OBIS561LS
니콘 도립 현미경	니콘	이클립스 Ti
증권 시세	증권 시세	프라임95B

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