단백질-포스포이노시티드 상호작용을 검출하기 위해 지원되는 지질 이중층에 대한 pH 조절 분석

초록

출처: Shengjuler, D., et al., PIP-on-a-chip: 단백질-포스포이노시티드 상호 작용에 대한 무표지 연구. J. Vis. 특급 (2017)

이 비디오에서는 미세유체 플랫폼이라고 하는 지지된 지질 이중층의 포스파티딜에탄올아민 지질에 태그가 지정된 pH 민감 형광 염료를 사용하여 pH 조절 분석을 사용하여 미세유체 패턴의 단백질-포스포이노시티드 상호 작용을 시연합니다. 단백질이 인지질에 결합한 후 pH의 조절은 형광 소멸을 유발합니다.

프로토콜

1. 지원되는 지질 이중층(SLB) 형성

1. 100μL의 PI(4,5)P2 함유 SUV를 0.65mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 6.4 μL의 0.2 N 염산을 추가하여 용액의 pH를 ~3.2로 조정합니다
   메모: 마이크로 pH 프로브가 장착된 pH 측정기로 용액의 pH를 확인합니다(재료 표 참조).
2. pH-adjusted SUV 용액 10 μL를 주입구를 통해 각 채널로 피펫을 주입하고 용액이 배출구에 도달할 때까지 피펫을 통해 압력을 가합니다. 피펫에서 팁을 분리하고 장치에 부착된 상태로 둡니다.
3. 각 채널에 대해 위의 단계를 반복한 다음 RT.
   에서 10분 동안 장치를 배양합니다. 메모: 마이크로 채널로의 소포 주입은 장치 조립 직후에 수행되어야 합니다.
4. 각각 60cm(입구 튜브) 및 8cm(출구 튜브) 길이의 입구 및 출구 튜브 세트를 절단합니다.
   메모: 튜브를 대각선으로 자르고 날카로운 모서리를 만들면 튜브를 입구와 출구에 쉽게 삽입할 수 있습니다. 배출구 튜브는 호 모양이어야 합니다. 주입구 튜브의 길이는 현미경 설정에 따라 달라질 수 있습니다. 튜브의 내경은 0.05cm입니다.
5. 핀셋을 사용하여 콘센트 튜브 세트를 장치에 연결한 다음 장치를 현미경 스테이지에 테이프로 붙입니다.
6. 주입구 튜빙 세트의 한쪽 끝을 원뿔형 튜브에 들어 있는 25mL의 러닝 버퍼에 담그고 테이프로 붙여서 튜브가 고정되었는지 확인합니다.
7. 중력 흐름을 통해 마이크로 채널을 통해 용액을 밀어 넣기 위해 장치보다 높은 지면(~20cm)에 원추형 튜브를 놓습니다. 이를 달성하기 위해 랩 잭을 사용할 수 있습니다.
8. 각 Inlet 튜브에 대해 주사기를 사용하여 튜브의 다른 쪽 끝에서 1mL의 러닝 버퍼를 뽑습니다. 주입구에서 피펫 팁을 제거하고 주입구 튜브의 다른 쪽 끝을 장치에 삽입합니다.
   메모: 이 단계에서 기포가 채널로 유입될 가능성을 줄이기 위해 주입구에 러닝 버퍼를 한 방울 떨어뜨립니다. 주입구 튜브를 장치에 부착한 후 보푸라기가 없는 천을 사용하여 초과 버퍼를 제거합니다.
9. 위의 단계를 반복하여 모든 입구 튜브 조각을 장치에 연결합니다.
   메모: 채널을 통해 흐르는 버퍼는 과도한 소포를 제거하고 이중층을 실험 조건으로 평형화하는 데 도움이 됩니다.
10. 현미경 제어 소프트웨어를 엽니다(재료 표 참조). 왼쪽 패널에서 "현미경" 탭을 클릭하고 "10X" 대물렌즈를 선택합니다.
11. "Live"를 클릭한 다음 도구 모음에서 "Alexa 568" 이미지 아이콘을 클릭합니다. 미세 및 코스 조정 손잡이를 사용하여 마이크로 채널에 초점을 맞춥니다.
12. 장치를 스캔하여 SLB 및 채널의 품질을 확인합니다(그림 1). 그런 다음 도구 모음에서 "FL Shutter Closed" 이미지 아이콘을 클릭합니다.
13. "Acquisition" 탭을 클릭하고 "Basic adjustments"에서 "Exposure time"을 선택합니다. 노출 시간을 "200ms"로 설정합니다.
14. 왼쪽 패널에서 "Multidimensional Acquisition"을 클릭하고 필터 메뉴에서 빨간색 채널("Alexa 568"로 표시)을 선택합니다. 그런 다음 "타임랩스" 메뉴를 클릭하고 시간 간격을 5분으로, 지속 시간을 30분으로 설정한 다음 "시작"을 클릭합니다.
    메모: 지속 시간(30분) 및 유속(~1.0μL/분)을 기준으로 30μL의 러닝 버퍼가 채널 내에서 SLB를 평형화하는 데 사용됩니다(즉, 240μL의 러닝 버퍼가 8개 채널 모두에 사용됩니다).
15. "측정" 탭에서 "원" 도구를 선택하고 아무 채널에서나 원을 그립니다. 원이 선택된 상태에서 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 "속성"을 선택합니다. "프로필" 탭에서 "모두 T"를 선택하여 형광 강도를 시간 함수로 표시합니다.
    1. 다음 단계로 진행하기 전에 이 곡선이 평형을 나타내는 고원에 도달했는지 확인하십시오.
16. 흐름을 중지하기 위해 버퍼 용액을 장치와 동일한 접지로 낮추십시오.
17. 타임랩스 파일을 저장합니다.

2. PI(4,5)P2 포함 SLB와의 PLC-δ1 PH 도메인 상호 작용 테스트

1. 실행 중인 버퍼를 희석제로 사용하여 PH 영역의 희석액을 준비합니다.
   메모: 장치 내에는 8개의 채널이 있으므로 그 중 2개 이상을 빈 컨트롤에 사용하십시오. 양쪽의 맨 끝을 선택하고 나머지 채널을 단백질 희석에 사용합니다. 0.10, 0.25, 0.50, 1.00 및 2.50μM의 PH 도메인 농도를 테스트했습니다. 각 희석액의 약 200μL는 30분 이내에 평형에 도달하기에 충분했습니다.
2. 한 번에 하나씩 각 배출구 튜브를 분리하고 피펫을 사용하여 각 단백질 희석액 200μL를 배출구 채널에 적용합니다. 압력을 가하지 말고 중력이 일을 하도록 하십시오. 피펫에서 팁을 분리하고 미세유체 장치에 부착된 상태로 둡니다.
3. 각 채널에 대해 위의 단계를 반복하고 이 과정에서 기포가 채널에 유입되지 않도록 합니다.
4. 입구 튜브를 미세유체 장치 아래의 바닥으로 낮추어 미세채널을 통해 단백질을 흐르게 합니다. 튜브의 다른 쪽 끝을 폐기물 용기에 테이프로 붙입니다. 단백질 희석액을 30분 동안 흘려보냅니다.
   메모: 이것은 흐름을 역전시키고 단백질이 채널로 도입될 수 있도록 합니다. 평형을 이루는 시간과 필요한 단백질 희석량은 상호 작용의 친화도에 따라 달라집니다.
5. 소프트웨어의 왼쪽 패널에서 "Time Lapse" 탭에서 "시작"을 클릭하여 이미징을 다시 시작합니다.
6. 실험이 완료되면 타임랩스 파일을 저장합니다.

결과

그림 1: SLB 및 마이크로채널의 무결성 평가. (A) 고품질 SLB 및 마이크로채널을 보여주는 이미지. (B) 불완전 융합. (C) 융합된 마이크로채널. (D) 마이크로 채널 내에 갇힌 먼지 입자. (E) 마이크로 채널 내에 갇힌 기포.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1-팔미토일-2-올레오일-SN-글리세로-3-포스포콜린	Avanti 극성 지질	850457C	팝
L-α-포스파티딜이노시톨-4-포스페이트	Avanti 극성 지질	840045엑스	파이4P
L-α-포스파티딜이노시톨-4,5-비스포스페이트	Avanti 극성 지질	840046X	파이(4,5)피2
1-팔미토일-2-올레오일-SN-글리세로-3-포스포에탄올아민	Avanti 극성 지질	850757C (영문)	교황; oSRB-POPE의 합성에 필요
Lissamine Rhodamine B Sulfonyl Chloride (혼합 이성질체)	써모피셔 사이언티픽	L-20	oSRB-POPE의 합성에 필요
pH-Sensitive 형광 지질 프로브(oSRB-POPE)	사내	해당 사항 없음	사내 합성(Huang D. et al. 2013)
Axiovert 200M 에피 형광 현미경	Carl Zeiss 현미경 검사	해당 사항 없음	현미경
AxioCam MRm 카메라	Carl Zeiss 현미경 검사	해당 사항 없음	사진기
엑스-인용 120	엑셀리타스 테크놀로지스	해당 사항 없음	조명 공급원
Alexa 568 필터 세트	Carl Zeiss 현미경 검사	해당 사항 없음	Ex/Em 576/603 nm
AxioVision LE64 v.4.9.1.0 소프트웨어	Carl Zeiss 현미경 검사	해당 사항 없음	이미지 프로세싱 소프트웨어
팁	폭스바겐	10034-132	200 uL 피펫 팁; 단백질 용액을 미세유체 채널로 적용하기 위한 얇고 매끄러운 팁
팁	폭스바겐	53509-070	10 uL 피펫 팁; 소포 용액을 미세유체 채널에 적용하기 위한 얇고 매끄러운 팁
Orion Star A321 pH 측정기	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	STARA3210	pH 측정기
오리온 마이크로 pH 프로브	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	8220BNWP	마이크로 pH 프로브
N-(2-하이드록시에틸)-피페라진-N'-(2-에탄술폰산)	폭스바겐	VWRB30487	HEPES, 유리 산
소금	폭스바겐	BDH8014-2.5KGR	염화나트륨
배관	Allied Wire & Cable (연합군 전선 및 케이블	TFT-200-24 N	내부 직경 : 0.020-0.026 인치 (0.051-0.066 cm); 벽 두께: 0.010인치(0.025cm); 유연한 폴리테트라플루오로에틸렌 박벽 튜브; 자연 색상
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