단백질-리간드 상호 작용을 모니터링하기 위한 정량적 세포 내 수소 NMR 분광법

초록

출처: Barbieri, L. et al., High Cell Density Bioreactor를 사용하여 실시간 정량적 세포 내 NMR로 인간 세포의 단백질-리간드 상호 작용 모니터링.J. Vis. 특급(2021년)

이 비디오에서는 표지되지 않은 과발현 단백질과 소분자 사이의 단백질-리간드 상호 작용을 연구하기 위한 세포 내 핵 자기 공명 분광법 기술을 시연합니다. 성공적인 리간드-단백질 상호 작용은 원래 피크를 점차적으로 대체하는 관심 스펙트럼 영역에 추가 피크 세트의 출현으로 시각적으로 확인됩니다.

프로토콜

1. 시약 및 용액 설정

1. 완전한 DMEM을 준비하려면 440mL DMEM에 5mL L-글루타민 200mM, 5mL 페니실린-스트렙토마이신 100x 및 50mL 소 태아 혈청(FBS, 10% vol/vol 최종 농도)을 추가합니다.
   메모: 이 용액은 4°C에서 1개월 동안 보관할 수 있습니다.
2. 150mg의 저겔화 아가로스를 85°C에서 10mL의 인산염 완충 식염수(PBS)에 용해시켜 1.5%(w/v) 용액을 얻어 아가로스 용액을 준비합니다. 0.22μm 필터로 여과하여 살균합니다. 1.5N에서 1mL의 아가로스 용액 분취액을 준비합니다
.
3. 생물반응기 매체를 준비합니다.
   1. 13.4g의 DMEM 분말을 1L의 초순수 H₂O.
      에 용해시킵니다. 메모: 응용 분야에 따라 필요한 최종 부피가 다를 수 있습니다(예: 500mL 배지의 경우 500mL H₂O에 6.7g의 분말을 용해).
   2. 2% FBS, 10mM NaHCO₃, 1x 페니실린-스트렙토마이신(100x) 및 2% D₂O를 추가합니다(예: 500mL 배지의 경....

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
자료
구연산	시그마-알드리치	251275
D2O	시그마-알드리치	453366
DMEM, 고혈당	생명 기술	제10313-021
DMEM, 고포도당, 분말	시그마-알드리치	D5648
FBS(증권 시세	생명 기술	10270
염산(HCl)	시그마-알드리치	30721
L-글루타민(200mM)	생명 기술	25030
저겔화 아가로스, 분말	시그마-알드리치	A4018
NaHCO3, 분말	카를로 에르바	478537
PBS (PBS)	생명 기술	10010
페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/ml)	생명 기술	15140-122
NaOH 펠릿	시그마-알드리치	30620
트립신-EDTA (0.05% (wt/vol))	생명 기술	제25300-054
설비
5mm CryoProbe가 장착 된 Avance III 분광계	브루커	해당 없음	모든 최신 분광계와 5mm 프로브가 장착된 좁은 보어 자석이 호환됩니다.
InsightMR 플로우 유닛	브루커	해당 없음
ÄKTA FPLC의 P-920 펌프 모듈	GE 헬스케어	해당 없음	모든 FPLC, HPLC 연동 펌프 또는 주사기 펌프는 유량 장치와 호환되어야 합니다.

호 표시기 년 년 년 년 호