단백질-리간드 상호 작용을 모니터링하기 위한 정량적 세포 내 수소 NMR 분광법

초록

출처: Barbieri, L. et al., High Cell Density Bioreactor를 사용하여 실시간 정량적 세포 내 NMR로 인간 세포의 단백질-리간드 상호 작용 모니터링.J. Vis. 특급(2021년)

이 비디오에서는 표지되지 않은 과발현 단백질과 소분자 사이의 단백질-리간드 상호 작용을 연구하기 위한 세포 내 핵 자기 공명 분광법 기술을 시연합니다. 성공적인 리간드-단백질 상호 작용은 원래 피크를 점차적으로 대체하는 관심 스펙트럼 영역에 추가 피크 세트의 출현으로 시각적으로 확인됩니다.

프로토콜

1. 시약 및 용액 설정

1. 완전한 DMEM을 준비하려면 440mL DMEM에 5mL L-글루타민 200mM, 5mL 페니실린-스트렙토마이신 100x 및 50mL 소 태아 혈청(FBS, 10% vol/vol 최종 농도)을 추가합니다.
   메모: 이 용액은 4°C에서 1개월 동안 보관할 수 있습니다.
2. 150mg의 저겔화 아가로스를 85°C에서 10mL의 인산염 완충 식염수(PBS)에 용해시켜 1.5%(w/v) 용액을 얻어 아가로스 용액을 준비합니다. 0.22μm 필터로 여과하여 살균합니다. 1.5N에서 1mL의 아가로스 용액 분취액을 준비합니다
.
3. 생물반응기 매체를 준비합니다.
   1. 13.4g의 DMEM 분말을 1L의 초순수 H₂O.
      에 용해시킵니다. 메모: 응용 분야에 따라 필요한 최종 부피가 다를 수 있습니다(예: 500mL 배지의 경우 500mL H₂O에 6.7g의 분말을 용해).
   2. 2% FBS, 10mM NaHCO₃, 1x 페니실린-스트렙토마이신(100x) 및 2% D₂O를 추가합니다(예: 500mL 배지의 경우 FBS 10mL, NaHCO₃ 0.4g, 페니실린-스트렙토마이신 100x 5mL 및_D2O10mL 추가).
   3. pH 측정기를 사용하여 pH를 측정하고 필요한 경우 HCl.
      를 추가하여 7.4로 조정합니다. 메모: 일반적으로 초기 pH는 7.4에 매우 가깝습니다.
   4. 멸균 250mL 또는 500mL 유리병에 진공 구동 멸균 필터로 바이오리액터 매체를 여과합니다.
   5. 층류 후드에서 두 개의 호스 노즐이 있는 멸균 강철 헤드피스로 병을 밀봉하고 펌프와 공기 흡입용 0.22μm PTFE 주사기 필터에 연결할 FEP 튜브(o.d. = 1/8", i.d. = 1.6mm)에 연결합니다.

2. 바이오리액터 설정

1. 두 번째 흐름 장치 NMR 튜브를 사용하여 흐름 장치를 조립하고 나중에 세포를 포함하는 튜브로 교체합니다. 올바른 어셈블리에 대해서는 유량 장치 작동 지침을 참조하십시오.
   메모: 이 시점에서 유량 장치는 이미 청소되어 있어야 합니다(그렇지 않은 경우 4.2단계 수행).
2. 유량 장치 온도 조절기에 연결된 수조를 37°C로 설정합니다. 물통 병을 수조에 넣습니다.
3. 저장 용기 병의 FEP 튜브를 펌프에 연결합니다.
4. 바이오리액터 밸브를 "바이패스"로 돌리고 펌프에 매체를 미리 채웁니다.
5. 바이오리액터 밸브를 "흐름"으로 돌리고 바이오리액터에 0.1mL/분의 배지를 미리 채웁니다.

3. 세포 샘플의 준비

1. CO₂ incubator에서 세포를 수집합니다.
   1. CO₂ incubator에서 transfection된 HEK293T 세포의 T75 플라스크를 가져와서 사용한 배지를 제거합니다.
   2. 실온(~20°C)에서 7mL(각)의 PBS로 세포를 두 번 세척합니다.
   3. 2mL의 트립신/EDTA를 사용하여 세포를 분리합니다. 용액을 첨가한 후 실온에서 5분 동안 배양하여 세포를 분리합니다.
      메모: 형질주입된 세포는 분리되는 데 시간이 약간 더 걸릴 수 있습니다. 필요한 경우 37°C에서 세포를 배양합니다.
   4. 20mL의 완전한 DMEM으로 트립신을 비활성화하고, 위아래로 피펫팅하여 50mL 원심분리 튜브에 옮겨 세포를 철저히 재현탁시킵니다.
   5. 실온에서 800 x g의 세포를 5분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다.
   6. 실온에서 10mL의 PBS로 셀을 세척하여 잔류 배지를 제거합니다.
   7. 실온에서 800 x g의 세포를 5분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다.
   8. 세포 펠릿을 1.5mL 뚜껑이 있는 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.
2. 아가로스 스레드에 셀을 포함합니다.
   1. 응고된 아가로스의 분취액 1개를 수조에서 85°C로 녹인 후 블록 히터에서 37°C의 용액에 보관합니다.
   2. 파스퇴르 피펫을 사용하여 흐름 단위 NMR 튜브의 바닥에 60-70 μL의 1.5 % 아가로 로즈 겔을 채우고 얼음에 넣습니다. 이것은 ^1HNMR 코일의 활성 부피 내에 셀 샘플을 배치할 수 있는 ~5mm 높이의 바닥 플러그를 생성합니다.
   3. 3.1.8 단계에서 얻은 셀 펠릿을 37 ° C에서 15-20 초 동안 thermoblock에서 가열합니다.
   4. 450μL의 아가로스 용액에 세포를 재현탁합니다. 거품이 형성되지 않도록 주의하십시오.
   5. 1mL 주사기에 연결된 ~30cm 길이의 크로마토그래피 PEEK 튜브(i.d. = 0.75mm)로 세포 아가로스 현탁액을 흡입합니다.
      메모: 흡인 전에 튜브와 주사기의 데드 볼륨은 기포 형성을 방지하기 위해 실온에서 PBS로 미리 채워져야 합니다. 튜브의 길이는 중요하지 않습니다.
   6. 튜브를 실온에서 2분 동안 식히십시오.
   7. 실온에서 flow unit NMR 튜브를 100μL의 PBS로 미리 채웁니다.
   8. 주사기를 부드럽게 밀어 아가로스에 내장된 세포의 실을 flow unit NMR 튜브로 캐스팅합니다.
      메모: NMR 튜브를 균일하게 채우려면 먼저 PEEK 튜브의 끝을 NMR 튜브의 하단에 놓고 좌우로 천천히 흔들면서 위쪽으로 진행합니다.
   9. 모든 세포 아가로스 현탁액이 캐스팅될 때까지 3.2.5, 3.2.6 및 3.2.8 단계를 반복합니다.
3. 생물반응기에 세포를 삽입합니다.
   1. 흐름 장치에서 빈 NMR 튜브를 제거하고 몇 분 동안 유속을 2mL/분으로 증가시켜 입구 튜브에 남아 있는 가스 기포를 제거합니다.
   2. 유속을 0.2mL/분으로 설정하고 세포가 들어 있는 NMR 튜브를 천천히 그러나 꾸준히 위쪽으로 밀어 삽입합니다.
      메모: 매체의 활성 흐름은 삽입 중에 발생할 수 있는 입구를 통한 튜브 내용물의 역류를 방지합니다.

4. 생물 반응기 작동 및 세척

1. NMR 실험 중 생물 반응기 작동.
   1. NMR 분광계의 온도를 310K로 설정합니다.
   2. 분광계에 유량 장치를 삽입합니다.
   3. 세포 내 NMR 실험의 전체 기간 동안 0.1mL/분의 유속으로 생물반응기 배지를 공급합니다.
   4. 실험 중 원하는 시간에 멸균 장침 주사기로 실리콘 튜브를 뚫어 외부 분자의 농축된 용액을 매체 저장 병에 주입합니다.
      메모: 배지 내 분자의 최종 농도는 세포 독성에 대한 이전 지식을 기반으로 선택해야 하며, 사용 가능한 경우 세포막을 통한 예측/추정 확산 속도에 따라 선택해야 합니다.
   5. NMR 실험이 끝나면 세포가 들어있는 튜브를 빈 튜브로 교체하고 흐름 장치를 물로 헹굽니다.
2. 생물 반응기 clean-in-place.
   1. 다음 용액을 1mL/분으로 흐르게 하여 흐름 장치를 청소합니다: 0.2M 수산화나트륨(NaOH), 3M 구연산, 0.2M NaOH를 각각 30분 이상 동안 투여한 다음 멸균 여과된 초순수를 >2시간 동안 가열합니다.
   2. 각 실행 후에 저장 용기 병과 튜브 어셈블리를 청소하고 오토클레이브하십시오.

5. NMR 실험

1. NMR 실험 설정.
   메모: 세포 내 NMR 샘플을 준비하기 전에 이러한 단계를 미리 수행하여 세포 수집과 데이터 수집 사이의 지연을 방지합니다.
   1. NMR 분광계에서 새 데이터 세트를 만들고 원하는 NMR 실험에 대한 매개변수를 설정합니다.
   2. 1D ^1HNMR 실험에 대한 매개변수를 설정합니다.
   3. 물 신호에서 ^1H반송파 주파수를 4.7ppm으로 중앙에 배치합니다.
   4. zgesgp 펄스 프로그램을 선택하고, 스펙트럼 폭을 20ppm으로 설정하고, 수분 억제를 위해 1,000μs 180° 사각 펄스를 설정합니다. 스캔 간 지연을 1초로 설정합니다. 32회 스캔으로 스펙트럼을 획득합니다.
   5. 표지되지 않은 CA II를 발현하는 세포의 경우: p3919gp 펄스 프로그램을 선택하고, 스펙트럼의 이미노 영역을 커버하도록 스펙트럼 폭을 30ppm으로 설정하고, 최대 여기가 관심 신호의 화학적 이동(d7 = 950MHz에서 20μs)에 중심이 되도록 이항 수분 억제에 대한 지연을 조정합니다. 스캔 간 지연을 ≥1초로 설정합니다. 512회 스캔으로 획득합니다.
   6. ¹⁵N 표지 SOD1을 발현하는 셀의 경우: sfhmqf3gpph 펄스 프로그램을 선택하고, ¹H 및 ¹⁵N 스펙트럼 폭을 각각 16 및 50 ppm으로, 형상 펄스 오프셋 및 여기 대역폭을 각각 8.5 및 6 ppm으로, 디커플링 방식을 위한 350 μs 펄스(기기에 따라 garp4 또는 기타)를 설정합니다. 스캔 간 지연을 0.3초로 설정합니다. ^15N차원에서 16개의 스캔과 128개의 증분을 획득합니다.
2. 실시간 NMR 스펙트럼 획득.
   1. 생물 반응기가 NMR 분광계에 삽입되면 배지를 교환 할 수 있도록 몇 분 동안 기다립니다.
      메모: 이 프로세스는 PBS가 2%_D2O를 포함하는 매체로 대체됨에 따라 잠금 신호의 모양에서 쉽게 모니터링할 수 있습니다.
   2. ^1H채널의 정합 및 튜닝을 조정하고 자석을 끼우고 ^1H90° 하드 펄스 길이를 계산합니다.
   3. ^1H하드 펄스에 따라 각 펄스 시퀀스에서 ^1H출력 수준을 조정합니다.
   4. 첫 번째 zgesgp ¹H 스펙트럼을 기록하여 샘플 성분과 필드 균질성을 확인합니다.
   5. zgesgp 및 p3919gp/sfhmqcf3gpph 실험을 원하는 숫자로 복사하고 수집 스풀러에 대기열에 넣습니다.
      캘리포니아: zgesgp 스펙트럼은 샘플의 상태와 필드 균질성을 제어하는 데만 사용됩니다. 따라서 건너뛰거나 덜 자주 기록될 수 있습니다.
   6. 표지되지 않은 CA II를 발현하는 세포의 경우: zero filling 및 exponential line broadening window 함수(LB = 20Hz)를 적용하여 p3919gp 스펙트럼을 처리합니다.
   7. ¹⁵개의 N-표지된 SOD1을 발현하는 세포의 경우: 두 차원 모두에 0 채우기 및 제곱 사인 벨 창 기능(SSB = 2)을 적용하여 sfhmqcf3gpph 스펙트럼을 처리합니다.
      메모: 처리된 스펙트럼의 크기는 신호가 없는 영역을 제거함으로써 더욱 감소될 수 있습니다(Topspin에서는 원하는 STSR 및 STSI 값을 설정하여 수행됨).

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
자료
구연산	시그마-알드리치	251275
D2O	시그마-알드리치	453366
DMEM, 고혈당	생명 기술	제10313-021
DMEM, 고포도당, 분말	시그마-알드리치	D5648
FBS(증권 시세	생명 기술	10270
염산(HCl)	시그마-알드리치	30721
L-글루타민(200mM)	생명 기술	25030
저겔화 아가로스, 분말	시그마-알드리치	A4018
NaHCO3, 분말	카를로 에르바	478537
PBS (PBS)	생명 기술	10010
페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/ml)	생명 기술	15140-122
NaOH 펠릿	시그마-알드리치	30620
트립신-EDTA (0.05% (wt/vol))	생명 기술	제25300-054
설비
5mm CryoProbe가 장착 된 Avance III 분광계	브루커	해당 없음	모든 최신 분광계와 5mm 프로브가 장착된 좁은 보어 자석이 호환됩니다.
InsightMR 플로우 유닛	브루커	해당 없음
ÄKTA FPLC의 P-920 펌프 모듈	GE 헬스케어	해당 없음	모든 FPLC, HPLC 연동 펌프 또는 주사기 펌프는 유량 장치와 호환되어야 합니다.

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