Quartz-Crystal Microbalance 바이오센서 기반 바이오패닝으로 단백질-약물 상호작용 연구

초록

출처: Takakusagi, Y. 약물-단백질 상호 작용의 글로벌 검증을 위한 바이오센서 기반 고처리량 바이오패닝 및 생물정보학 분석 전략. J. Vis. 특급 (2020)

이 동영상은 T7 파지 표시 펩타이드 라이브러리의 QCM 바이오센서 기반 바이오패닝을 사용하여 단백질-약물 상호작용을 연구하는 방법을 보여줍니다. QCM 바이오센서에 특정 펩타이드를 표시하는 파지의 바이오패닝을 통해 친화성이 높은 펩타이드를 특이적으로 분리한 다음 아미노산 염기서열분석을 수행하여 표적 단백질의 특정 상호 작용 부위를 식별할 수 있습니다.

프로토콜

참고: 다음은 QCM 바이오센서를 사용하여 약물 인식 T7 파지를 스크리닝하고 대장균(BLT5615) 감염을 통해 스크리닝된 파지를 복구하는 단계입니다. 자체 조립 단층(SAM)을 형성하는 작은 분자의 유도체를 합성하고 T7 파지로 표시되는 15mer 랜덤 펩타이드 라이브러리를 구축하기 위한 프로토콜은 다른 곳에서 찾을 수 있습니다.

1. QCM 센서 칩의 준비

1. 27MHz QCM 장치의 발진기에 세라믹 센서 칩을 부착하고 소분자 고정화 전에 공기 상태의 고유 주파수(Hz)를 기록합니다.
2. 칩을 분리하고 피펫을 사용하여 센서 칩의 금 전극에 SAM을 형성하는 저분자 유도체 용액 20μL(70% 에탄올 중 1mM)를 떨어뜨립니다.
   주의: 금 전극(Au, 0.1mm 두께, 2.5mm i.d., 4.9mm²)이 위치한 센서 칩 결정은 매우 얇아서 쉽게 균열될 수 있습니다(SiO₂, 0.06mm 두께, 9mm id.). 따라서 조심스럽게 피펫을 사용하십시오.
3. 실온(약 20°C)에서 1시간 동안 젖은 티슈와 실내 조명으로부터 차폐된 페트리 접시에 그대로 두십시오.
4. 전극 표면을 초순수로 부드럽게 세척하십시오. 그런 다음 주사기나 공기 살포기로 공기를 불어 물방울을 제거합니다.
5. QCM 장치용 센서 칩을 설정하고 공기 상태의 주파수 감소를 기록하여 고정된 작은 분자의 양을 측정합니다.
   메모: 성공적인 소분자 고정을 위해서는 적어도 100Hz의 고유 주파수가 필요합니다(1Hz는 30pg를 고정화).

2. QCM 바이오센서를 사용한 T7 파지 라이브러리의 바이오패닝(그림 1)

1. QCM 바이오센서에 전용 자기 교반기가 있는 큐벳을 설정하고 반응 완충액 8mL(10mM Tris-HCl, 200mM NaCl, pH 7-8)를 큐벳에 붓습니다.
2. QCM 센서 칩을 오실레이터에 부착하고 오실레이터의 암을 아래로 당겨 1000rpm으로 교반하는 버퍼에 칩을 담그십시오.
3. 개인용 컴퓨터(PC)에서 QCM 주파수 모니터링을 시작하고 센서그램이 주파수 드리프트의 약 3Hz/min으로 평형을 이룰 때까지 기다립니다.
4. 8 μL의 T7 파지 라이브러리(1-2 ×^{10 10} pfu/mL)를 큐벳(최종 농도: 1-2 × 10⁷ pfu/mL)에 주입하고 센서의 주입 지점을 표시합니다.
5. 금 전극 표면에 고정된 작은 분자에 T7 파지가 10분 동안 결합되어 발생하는 빈도 감소를 모니터링합니다.
6. QCM 주파수 모니터를 중지하고 발진기에서 센서 칩을 분리한 다음 공기를 불어넣거나 물티슈로 심지를 제거하여 버퍼를 제거합니다.
7. 센서 칩을 습한 페트리 접시에 넣고 로그 위상에서 대장균(BLT5615) 현탁액 20μL(_600mM에 IPTG를 첨가하여 37°C에서 진탕한 후 OD 0.5 = 1.0) 숙주 세포를 금 전극에 떨어뜨립니다.
8. 접시의 뚜껑을 닫고 알루미늄 호일로 덮어 빛을 차단합니다.
9. 결합된 T7 파지의 회수를 향상시키기 위해 96웰 마이크로플레이트 믹서(1000-1500rpm)에서 37°C에서 30분 동안 접시를 배양합니다.
10. 용액 20μL를 회수하고 200μL의 LB medium.
    에 현탁합니다. 메모: 이 단계에서 얻은 샘플은 4°C에서 일주일 동안 보존할 수 있습니다.
11. 플라크 분리 및 DNA 염기서열분석을 위해 파지 용액의 희석 시리즈를 제조업체의 지침에 설명된 일반 절차에 따라 준비합니다.

결과

그림 1: T7 파지 표시 펩타이드 라이브러리의 QCM 바이오센서 기반 바이오패닝의 개략도. 무작위 펩타이드를 표시하는 T7 파지 라이브러리를 QCM 바이오센서 칩이 침지되고 주파수가 안정화되는 완충액(교반 중)이 포함된 큐벳에 주입합니다. 센서 칩의 금 전극 표면에 고정된 작은 분자에 대한 T7 파지의 결합으로 인한 주파수 감소를 모니터링한 후, 센서 칩을 발진기에서 분리합니다. 결합된 T7 파지의 DNA는 숙주 대장균(BLT5615) 감염 후 직접 회수됩니다. 생성된 T7 파지는 플라크 형성을 통해 분리되며, 최종적으로 T7 파지 캡시드에 표시된 약물 친화성 선택 펩타이드의 아미노산 서열은 일반적인 파지 표시 방법에 따라 결정됩니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
아피닉스큐	ULVAC, Inc. (일본 도쿄)	QCM2008-STKIT	유리 큐벳, 교반 자석, 작동 및 분석 소프트웨어가 Windows PC에 포함되어 있습니다.
세라믹 센서 칩	ULVAC, Inc. (일본 도쿄)	QCMST27C	4 센서 칩/패키지
디메틸 설폭사이드	시그마-알드리치 (미국 미주리주 세인트루이스)	D8418
에탄올	Merck (미국 뉴저지주 케닐워스)	09-0850
AFFINIX용 고정 키트	ULVAC, Inc. (일본 도쿄)	큐씨밈크트	SAM 시약 및 아민-커플링 시약
리퀴드 LB 미디엄	시그마-알드리치 (미국 미주리주 세인트루이스)	L3522	20분 동안 오토클레이브
염화나트륨	Merck (미국 뉴저지주 케닐워스)	S3014
트리스	Merck (미국 뉴저지주 케닐워스)	252859