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1. 시스템 준비
- MALS 및 dRI 검출기를 FPLC의 UV 검출기 다운스트림에 연결합니다. pH 및 전도도 검출기는 UV 검출기와 MALS 검출기 사이에 상당한 검출기 간 부피를 추가하므로 우회합니다. 컬럼에서 검출기까지 또는 검출기 사이에 0.25mm i.d.의 모세관 튜브를 사용하고, 검출기 출력부에 폐기물 또는 분획 분취기로 가는 0.75mm i.d. 모세관 튜브를 사용합니다.
- FPLC의 I/O 박스를 통해 UV 검출기에서 MALS 아날로그 입력으로의 아날로그 출력과 FPLC에서 MALS 자동 주입으로의 디지털 출력을 포함하여 FPLC와 검출기 사이에 필요한 신호 연결이 설정되었는지 확인합니다.
- 최소 20kDa에서 500kDa의 분획 범위를 포괄하는 적절한 분석용 SEC 컬럼을 설치합니다. 제품 정보를 확인하여 컬럼이 MW, pH 및 샘플과 이동상의 기타 특성 범위에 적합한지 확인하십시오.
2. 버퍼 준비, 밤새 시스템 세척 및 청결도 확인
- HPLC 등급 시약을 사용하여 50-100mM NaCl이 함유된 인산염 완충 식염수 1L를 준비합니다. 보틀탑 폴리에테르 설폰 필터 또는 이와 유사한 것을 사용하여 버퍼를 0.1μm로 필터링합니다. 처음 50-100mL의 완충액을 폐기물 병에 여과하고 버려 건조 필터에서 미립자를 제거한 다음 나머지를 여과된 탈이온수로 철저히 세척하고 먼지가 들어가지 않도록 뚜껑을 씌운 깨끗하고 멸균된 병에 여과합니다.
메모: Tris 완충액과 같은 다른 이동상 용매는 이러한 용매에 우선적으로 용해된 추가 단백질을 분석해야 하는 경우 사용할 수 있습니다.
- 0.5mL/분의 유속으로 밤새 플러시하거나 컬럼 제조업체에서 권장하는 대로 세척하여 버퍼의 컬럼을 평형화하고 미립자를 제거합니다. FPLC의 연속 흐름 모드를 사용하여 모든 SEC-MALS 실행이 완료될 때까지 흐름이 중지되지 않도록 합니다.
- 밤새 플러시하는 동안 dRI 플로우 셀을 퍼지 모드로 설정합니다. 샘플 실행을 시작하기 전에 퍼지를 끕니다.
- 플러시를 시작할 때 컬럼의 갑작스러운 압력 변화로 인한 "컬럼 흘림" 효과(또는 입자 방출)를 방지하기 위해 유속을 점진적으로 증가시킵니다.
- 시스템이 매우 안정적이고 입자가 없으며 원하는 이동상과 평형을 이루는 것으로 알려진 경우 야간 플러시를 더 짧은 2-3시간 플러시로 교체하십시오.
- 컬럼 다운스트림의 튜빙을 가볍게 두드려 축적된 입자를 방출하고 MALS 기기의 전면 패널 디스플레이에 있는 90° 검출기에서 신호를 관찰하여 시스템 청결도를 확인합니다. 피크 대 피크 잡음이 50 -100μV 이하인지 확인합니다.
- '블랭크' 주입을 수행하여 주입기에 입자가 없는지 확인합니다. '블랭크'는 신선하고 멸균된 바이알에서 준비된 작동 중인 버퍼입니다.
- 입자 피크의 부피가 1mL 이하이고 기준선보다 5mV 이상 높지 않으면 시스템이 샘플을 사용할 준비가 된 것입니다. 그렇지 않으면 깨끗해질 때까지 추가 블랭크 주입을 수행하거나 주입기를 청소하기 위한 유지 관리를 수행하십시오.
3. 샘플 준비 및 불러오기
- SEC 완충액에서 1-2 mg/mL로 최소 200 μL의 BSA를 준비합니다.
메모: 침전을 방지하기 위해 BSA는 절대 순수한 물에 용해되어서는 안 됩니다.
- 주사기 팁 필터를 사용하여 단백질을 0.02μm로 필터링합니다.
- 건조 필터에서 입자를 제거하기 위해 처음 몇 방울의 여과액을 버리십시오.
- 또는 10,000 x g에서 15분 동안 시료를 원심분리하여 불용성 응집체 및 기타 큰 입자를 침전시킬 수 있습니다.
- BSA 용액 100μL를 루프에 주입합니다.
메모: 이것은 권장되는 물질의 양이며, 안정성 또는 가용성과 같은 샘플의 상황에 따라 더 많거나 적은 물질이 주입될 수 있습니다. 주입 당 필요한 단백질의 양은 분자량에 반비례하여 달라지며, 분자량이 33 kDa 또는 BSA의 절반 인 경우 필요한 단백질 질량의 두 배입니다.
4. MALS 소프트웨어 준비
- 새로 열기 | MALS 소프트웨어 메뉴의 방법에서 실험하고 광 산란 시스템 방법 폴더에서 온라인 방법을 선택합니다. DLS 디텍터가 있는 경우 Light Scattering(광 산란)에서 Online method(온라인 방법)를 선택합니다. QELS 폴더 포함.
- Configuration 섹션에서 샘플 및 이동상의 매개변수를 설정합니다.
- Generic Pump 보기에서 FPLC에서 사용되는 유량으로 설정합니다.
- Generic Pump 보기의 Solvent 분기, Name 필드에서 PBS를 선택합니다.
- Injector 보기의 Sample branch에서 Name을 BSA로 입력하고 dn/dc = 0.185(변형되지 않은 단백질의 표준 값), A2 = 0 및 UV 흡광 계수 = 0.667 mL/(mg-cm).
를 설정합니다.
메모: 다른 단백질의 경우, UV280 nm 흡광 계수는 문헌에서 찾거나 다양한 공개 도메인 소프트웨어 도구를 사용하여 그 순서에서 계산할 수 있습니다.
- Procedures(절차) 섹션의 Basic Collection(기본 수집) 보기에서 Trigger on Autoinject(자동 주입 트리거) 확인란을 선택하고 실행 기간을 70분으로 설정하여 SEC 열의 총 투과 부피에 도달할 때까지 전체 용리에 대한 데이터가 수집되도록 합니다.
메모: 필요한 시간은 컬럼 및 유속에 따라 달라질 수 있으며, 표준 7.8mm x 300mm HPLC-SEC 컬럼의 경우 0.5mL/분에서 35분의 수집이 필요합니다.
- 실행 버튼을 클릭하여 MALS 소프트웨어에서 실험을 시작합니다. MALS 검출기를 통해 FPLC 기기에서 펄스 신호를 수신한 후 데이터 읽기를 시작합니다.
- 기기의 전면 패널에 있는 Autozero 버튼을 클릭하여 dRI 신호를 제로화합니다.
5. FPLC 소프트웨어 준비
- 단백질의 이름과 실행을 FPLC 소프트웨어의 Manual | 수동 명령 실행 | 세트 마크.
- 주입 밸브를 Manual load에서 Inject under Flow path로 전환합니다. 주입 밸브.
- I/O 상자 아래에 0.5s 펄스를 삽입하여 펄스 신호 포함 | 펄스 디지털 출력. 이렇게 하면 MALS 소프트웨어에서 데이터 수집이 트리거됩니다.
6. 샘플을 루프에 주입합니다. FPLC 소프트웨어에서 실행을 클릭하여 실험 실행을 시작합니다.