Bimolecular Complementation Affinity Purification - 두 개의 상호 작용하는 단백질을 분리합니다.

Abstract

출처: Hastings, J. F. et al. BiCAP(Bimolecular Complementation Affinity Purification)에 의한 다중 단백질 신호 복합체 해부. J. Vis. 특급 (2018)

이 비디오에서는 형태 특이적 단일 도메인 항체를 사용하여 특정 단백질 이량체를 검출하고 분리하는 BiCAP(bimolecular complementation affinity purification)을 시연했습니다.

Protocol

1. 세포 배양 및 Transfection

참고: BiFC 벡터의 transfection을 위해서는 높은 효율과 상대적으로 균일한 transfection을 달성하는 것이 중요합니다. 벡터는 모든 표준 transfection 시약과 호환될 가능성이 높으며, 그에 따라 transfection 조건을 최적화해야 합니다. 질량 분석을 수행하기 위해 일반적으로 10cm 접시 내에서 세포를 배양하지만, 더 적은 재료가 필요한 실험을 위해 더 작은 접시 또는 플레이트로 비례적으로 축소할 수도 있습니다.

1. 10cm 접시에 10⁶ HEK293T 세포 1.0× 10mL를 넣고 10% FBS와 페니실린/스트렙토마이신을 보충합니다(1:100).
2. 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에서 각 BiFC 벡터 2.5μg을 500μL의 트랜스펙션 완충액(재료 표 참조)으로 희석합니다.
3. 10μL의 transfection 시약을 추가합니다(재료 표 참조).
4. 와류 혼합물을 10초 동안 사용한 다음 간단히 원심분리합니다. 실온에서 10분 동안 배양합니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM을 참조하십시오.	지브코	11995-073	세포 배양
FBS(증권 시세	라이프 테크놀로지스 오스트레일리아	제10099-141	세포 배양
페니실린/스트렙토마이신	라이프 테크놀로지스 오스트레일리아	제15070-063	세포 배양
jetPRIME 트랜스펙션 완충액	폴리플러스	114-15	세포 배양
jetPRIME 트랜스펙션 시약	폴리플러스	114-15	세포 배양
PhosSTOP(인산가수분해효소 억제제)	시그마-알드리치	4906837001	세포 배양
완전한, 미니, EDTA-free 프로테아제 억제제 칵테일	로슈	11873580001	플라스틱 도자기
셀 스크레이퍼	사르슈테트	83.1832
GFP-Trap_A	크로모텍 Gmbh	GTA-100	아가로스 비드에 결합된 GFP 나노바디
N-말단 GFP 단클론 항체	코밴스	MMS-118P	BiFC 벡터 내에서 V1 태그를 감지합니다.
C-말단 GFP 단클론 항체	로슈	11814460001	BiFC 벡터 내에서 V2 태그를 감지합니다.
샘플 버퍼	인비트로젠	NP0008	1mL β-메르캅토에탄올 함유.
염기서열분석 등급의 변형된 트립신	프로메가 코퍼레이션	V5117H	세포 배양
LoBind 마이크로 원심분리기 튜브	현장 진단	0030 108 116	플라스틱 도자기
요오도아세트아미드	시그마-알드리치	I1149-5G	초순수에서 5mg/mL로 준비
LTQ Orbitrap 벨로스 프로	써모 피셔
DH5α 세포	써모 피셔		열 충격 흡수 전지