Bimolecular Complementation Affinity Purification - 두 개의 상호 작용하는 단백질을 분리합니다.

초록

출처: Hastings, J. F. et al. BiCAP(Bimolecular Complementation Affinity Purification)에 의한 다중 단백질 신호 복합체 해부. J. Vis. 특급 (2018)

이 비디오에서는 형태 특이적 단일 도메인 항체를 사용하여 특정 단백질 이량체를 검출하고 분리하는 BiCAP(bimolecular complementation affinity purification)을 시연했습니다.

프로토콜

1. 세포 배양 및 Transfection

참고: BiFC 벡터의 transfection을 위해서는 높은 효율과 상대적으로 균일한 transfection을 달성하는 것이 중요합니다. 벡터는 모든 표준 transfection 시약과 호환될 가능성이 높으며, 그에 따라 transfection 조건을 최적화해야 합니다. 질량 분석을 수행하기 위해 일반적으로 10cm 접시 내에서 세포를 배양하지만, 더 적은 재료가 필요한 실험을 위해 더 작은 접시 또는 플레이트로 비례적으로 축소할 수도 있습니다.

1. 10cm 접시에 10⁶ HEK293T 세포 1.0× 10mL를 넣고 10% FBS와 페니실린/스트렙토마이신을 보충합니다(1:100).
2. 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에서 각 BiFC 벡터 2.5μg을 500μL의 트랜스펙션 완충액(재료 표 참조)으로 희석합니다.
3. 10μL의 transfection 시약을 추가합니다(재료 표 참조).
4. 와류 혼합물을 10초 동안 사용한 다음 간단히 원심분리합니다. 실온에서 10분 동안 배양합니다.
5. DNA transfection 혼합물을 적가형으로 플레이트에 추가합니다. BiFC 융합 단백질이 상호 작용하고 금성 접힘 및 형광단 성숙을 위해 충분한 시간 동안 세포를 배양합니다(일반적으로 ~8 - 24 h.
   참고: 금성의 최대 여기는 515nm이고 최대 방출은 528nm이지만, 이는 GFP 형광을 시각화하기 위해 설정된 표준 형광 현미경을 사용하여 쉽게 볼 수 있습니다.

2. 샘플 준비

1. 용해물 수확
   1. 용해물을 수집하기 전에 세포 용해 완충액[50mM Tris-HCl(pH 7.4), 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1%(v/v) 비이온 세제(재료 표 참조)]를 준비합니다. 4 °C에서 보관하십시오.
   2. 수확 직전에 10mL의 Cell Lysis Buffer에 프로테아제 억제제 및 인산가수분해효소 억제제를 보충합니다(재료 표 참조). 보충된 Cell Lysis Buffer를 얼음 위에 보관하십시오.
   3. 얼음처럼 차가운 PBS에서 세포를 두 번 세척합니다. PBS를 흡인하고 얼음처럼 차가운 보충제 Cell Lysis Buffer 1mL를 추가합니다. 접시를 얼음 위에 놓고 완충액이 전체 표면적에 퍼지도록 합니다.
   4. 얼음 위에서 약 5분 동안 배양한 다음 세포 스크레이퍼(재료 표 참조)를 사용하여 세포를 긁어내고 미리 냉각된 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.
   5. 수집된 용해물을 18,000 × g에서 4°C에서 5분 동안 원심분리하여 세포 파편을 제거하고 투명화된 상층액을 새로운 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
      메모: 이 시점에서 용해물을 즉시 사용하거나 -80°C에서 보관할 수 있습니다. 또한 transfection 및 affinity purification의 효율성을 검증할 수 있도록 crude lysate의 부분 표본을 유지하는 것이 좋습니다.
2. 친화력 순화
   메모: BiCAP 분리 단계는 아가로스 비드에 접합된 GFP 나노바디를 사용하여 수행됩니다(재료 표 참조).
   1. 1mL PBS에서 적절한 부피(샘플당 20μL + 10μL 초과량)를 세척하여 아가로스 비드를 준비합니다. 비드를 300 x g에서 원심분리하고 상층액을 제거합니다.
   2. 각 용해물 샘플에 20μL를 추가합니다.
   3. 종단 간 회전으로 4 °C에서 2 시간 동안 샘플을 배양합니다 .
      메모: 이 시점에서 SDS-PAGE 및 웨스턴 블로팅(western blotting) 또는 질량 분석법을 통한 분석을 위해 샘플을 준비할 수 있습니다.
3. 웨스턴 블로팅을 위한 BiCAP 용리액 준비.
   1. 300 x g에서 비드를 원심분리하고 Cell Lysis Buffer에서 3회 세척합니다.
   2. 세척된 비드를 적절하게 희석된 샘플 버퍼 50μL에 재현탁하고(재료 표 참조) 샘플을 95°C에서 2-3분 동안 가열합니다.
      메모: 이러한 방식으로 준비된 샘플은 -20°C에서 몇 달 동안 보관할 수 있습니다.
   3. V1 태그 및 V2 태그(Table of Materials(재료 표 참조) 및 기타 관심 단백질에 대해 SDS-PAGE 및 웨스턴 블로팅을 수행합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
DMEM을 참조하십시오.	지브코	11995-073	세포 배양
FBS(증권 시세	라이프 테크놀로지스 오스트레일리아	제10099-141	세포 배양
페니실린/스트렙토마이신	라이프 테크놀로지스 오스트레일리아	제15070-063	세포 배양
jetPRIME 트랜스펙션 완충액	폴리플러스	114-15	세포 배양
jetPRIME 트랜스펙션 시약	폴리플러스	114-15	세포 배양
PhosSTOP(인산가수분해효소 억제제)	시그마-알드리치	4906837001	세포 배양
완전한, 미니, EDTA-free 프로테아제 억제제 칵테일	로슈	11873580001	플라스틱 도자기
셀 스크레이퍼	사르슈테트	83.1832
GFP-Trap_A	크로모텍 Gmbh	GTA-100	아가로스 비드에 결합된 GFP 나노바디
N-말단 GFP 단클론 항체	코밴스	MMS-118P	BiFC 벡터 내에서 V1 태그를 감지합니다.
C-말단 GFP 단클론 항체	로슈	11814460001	BiFC 벡터 내에서 V2 태그를 감지합니다.
샘플 버퍼	인비트로젠	NP0008	1mL β-메르캅토에탄올 함유.
염기서열분석 등급의 변형된 트립신	프로메가 코퍼레이션	V5117H	세포 배양
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