DNA Aptamer-Thermolabile Ligand 상호 작용을 연구하기 위한 시차 주사 열량계

초록

출처: Mittermaier, A. K., et al. 열불안정 리간드로 생체 분자 DSC 프로파일을 측정하여 접힘 및 결합 상호 작용을 신속하게 특성화합니다. J. Vis. 특급 (2017년)

이 비디오는 생체 분자와 리간드 사이의 상호 작용을 연구하는 기술인 시차 주사 열량계를 보여줍니다. DNA 압타머와 열불안정 리간드의 결합은 샘플에 반복적인 가열 및 냉각 주기를 적용하고 열역학 분석을 위한 스캔을 얻어 연구합니다.

프로토콜

1. 샘플 준비

1. 원하는 생체 분자를 정제합니다.
   메모: 이 프로토콜은 2 M NaCl을 3회 교환한 후 구매한 코카인 결합 DNA 압타머 MN4를 사용한 후 3 kDa 분자량 차단 멤브레인이 있는 원심 필터를 사용하여 3회 탈이온수를 사용합니다.
2. 합성 및 정제하거나 원하는 열불안정 리간드를 구입하십시오.
   메모: MN4는 열불안정성 리간드 코카인과 결합합니다. MN4는 또한 이러한 실험 온도에서 리간드 열성에 대한 음성 대조군으로 사용되는 퀴닌과 결합합니다.
3. 정제된 생체 분자의 투석 및 리간드(MN4 및 여기에 사용된 리간드의 경우 20mM 인산나트륨 및 140mM NaCl 완충액, pH 7.4)의 용해를 위한 완충액을 준비합니다.
4. 0.5 - 1.0 kDa 컷오프가 있는 투석 튜브를 사용하여 최소 2 L의 완충액에 대해 생체 분자를 투석합니다.
5. 완충액과 완전히 평형을 이룬 0.2μm 필터를 통해 최종 완충액(작업 완충액이라고 함)을 필터링합니다.
6. 원하는 리간드 질량의 무게를 측정하고 여과된 작업 완충액에 용해시킵니다. 원하는 리간드 농도가 너무 작아 정확하게 칭량할 수 없는 질량을 필요로 하는 경우 농축된 리간드 스톡 용액(예: 10x)을 만듭니다.
   메모: 모든 DSC 실험에서 샘플과 리간드에 대해 동일한 working buffer를 사용하는 것이 중요하며, 즉, 리간드가 생체 분자와 다른 working buffer에 용해되는 실험은 수행하지 않아야 합니다. 이는 데이터에서 buffer mismatch artifacts를 유발할 수 있기 때문입니다.
7. 작동 완충액과 완전히 평형을 이룬 0.2μm 필터를 통해 생체 분자 스톡 용액을 여과합니다.
8. 흡광도 측정을 통해 생체 분자 농도를 측정합니다(MN4와 같은 핵산의 경우 260nm, 단백질의 경우 280nm).
9. 제조된 생체 분자와 리간드를 4°C 냉장고(MN4 및 여기에 사용된 리간드에 적합)에 보관하거나 생체 분자 및 리간드가 동결을 견디고 장기 보관이 필요한 경우 -20 또는 -80 °C에 보관합니다. DSC.
   에 로드하기 전에 테이블탑 탈기 장치(Table of Materials)에서 완충액, 생체 분자 및 리간드 용액의 가스를 제거합니다. 메모: 탈기는 더 높은 온도에서 DSC의 기포 형성을 방지하는 데 도움이 됩니다. 기포는 DSC 피크 모양과 기준선을 모호하게 하는 신호 아티팩트를 유발합니다.

2. DSC 준비

1. DSC에서 압력 핸들의 나사를 풉니다(재료 표 참조).
2. 작업 버퍼에서 실리콘 튜브를 연결하고 기준 모세관의 전면 플랜지(금속 개구부)에 부착합니다.
3. 후면 참조 플랜지를 전면 샘플 플랜지에 연결하여 참조 및 샘플 모세관 사이에 브리지를 만듭니다.
4. 진공 라인이 부착된 폐기물 플라스크로 연결되는 후면 샘플 플랜지에 실리콘 튜브 조각을 부착합니다.
5. 진공 라인을 켜서 200mL의 작업 버퍼로 DSC를 플러시합니다.
6. DSC의 참조 캐필러리를 작업 버퍼와 함께 로드합니다. 약 3 - 5cm 부분의 실리콘 튜브를 기준 모세관 플랜지에 부착합니다.
7. 1mL 피펫 팁을 후면 플랜지의 실리콘 튜브에 삽입합니다. 피펫으로 0.8mL의 작업 버퍼를 추출하고 버퍼가 있는 피펫 팁을 전면 참조 플랜지의 실리콘 튜브에 삽입합니다.
8. 피펫 플런저를 부드럽게 눌러 작동 버퍼를 전면 실리콘 튜브를 통해 기준 모세관으로 통과시키고 후면 플랜지에 부착된 피펫 팁으로 위로 통과시킵니다. 작동 버퍼 수준이 전면 실리콘 튜브 바로 위에 도달할 때까지 피펫 플런저를 누른 다음 작업 버퍼 수준이 후면 실리콘 튜브 바로 위에 도달할 때까지 피펫 플런저를 해제합니다.
   1. 작업 버퍼를 앞뒤로 전달하여 거품의 참조 모세관에서 볼륨을 제거합니다.
      메모: 일반적으로 용액을 앞뒤로 10번 통과하면 기포를 제거하기에 충분합니다.
9. 엄지 손가락으로 후면 피펫 팁을 덮고 후면 피펫 팁과 전면 피펫을 부드럽게 위로 당겨 실리콘 튜브가 부착된 참조 플랜지에서 제거합니다.
10. 2.6 - 2.9 단계에서와 같이 작업 버퍼를 사용하여 샘플 캐필러리를 로드합니다. 후면 참조에 검은색 플라스틱 캡을 놓고 플랜지를 샘플링하고 전면 플랜지는 덮지 않습니다.
11. 압력 핸들을 부착합니다.
12. DSC 소프트웨어(재료 표 참조)를 열고 전력 판독값이 안정화되면 인터페이스 상단에 있는 빨간색 위쪽 화살표를 클릭하여 기기에 압력을 가합니다. DSC 전력은 기기 온도 및 압력 판독값과 함께 인터페이스의 오른쪽 상단에 있는 상자에 표시됩니다.
    메모: DSC가 가압될 때 전력 판독값을 모니터링합니다. ~ 10μW 이상의 전력 변화는 모세혈관에 기포가 형성되어 데이터에 아티팩트가 발생할 수 있음을 나타냅니다. 계속하기 전에 용액을 추가로 제거하고 가스를 제거해야 합니다.
13. 정방향 및 역방향 스캔을 수행하여 DSC를 작업 버퍼와 평형을 이룹니다. 화면 왼쪽의 "Experimental Method" 탭에서 "Scanning" 옵션이 선택되어 있는지 확인하여 DSC를 온도 스캔 모드로 실행합니다.
    메모: 실험 매개변수는 온도 스캔 범위, 스캔 속도, 저온 및 고온 평형 시간, 스캔 횟수입니다.
    1. "Experimental Method" 탭 아래에 삽입된 "Temperature Parameters"에서 "Heating" 버튼을 클릭합니다. 실험 온도의 하한과 상한으로 100°C, 스캔 속도로 1°C/min, 평형 기간으로 60초를 입력합니다.
    2. 평형 기간에 대한 입력 필드 아래에 있는 "Add Series" 버튼을 클릭합니다. 팝업 창의 "추가 단계" 필드에 2를 입력하고(난방 스캔 1회 및 냉방 스캔 1회) "대체 가열/냉방" 상자를 선택합니다. "확인"을 클릭하십시오. 추가된 스캔이 인터페이스 하단에 나타납니다. 각 스캔에 대한 매개변수가 원하는 대로 지정되었는지 확인하십시오.
    3. 인터페이스 상단에 있는 녹색 "재생" 버튼을 클릭하여 실험을 시작합니다. 원하는 폴더로 이동하여 팝업 창에 실험을 저장할 파일 이름을 입력합니다. "실험 방법" 탭 오른쪽에 있는 "데이터" 탭을 클릭하여 실험 진행 상황을 확인합니다.

3. 열불안정 리간드 DSC 데이터 세트 수집

참고: 최소 절차는 5가지 실험으로 구성됩니다: 리간드를 사용하거나 사용하지 않은 완충 참조 실험(기준선 감산에 사용됨), 자유 생체 분자, 리간드 결합 생체 분자 및 고온 평형 기간이 더 긴 리간드 결합 생체 분자를 사용한 샘플 실험.

1. 표본 데이터의 기준선 빼기에 대한 참조 실험을 실행합니다. 두 모세관에서 작동 버퍼를 사용하여 DSC를 다시 로드하고 120초의 상한(고온) 평형 시간으로 1°C min-1의 적절한 온도 범위에서 여러 개의 정방향 및 역방향 스캔을 수집합니다.
   1. 각 항목을 개별적으로 강조 표시하고 인터페이스의 오른쪽 중간에 있는 빨간색 X를 클릭하여 인터페이스의 아래쪽 부분에서 이전 버퍼 평형 검사를 삭제합니다. "Add Series(시리즈 추가)" 버튼을 클릭하고 "Steps to add(추가할 단계)" 필드에 20을 입력한 다음 "Alternate Heating/Cooling(대체 가열/냉방)" 상자를 선택하여 새 스캔을 추가합니다. 확인을 클릭하고 위와 같이 녹색 재생 버튼을 클릭하여 실험을 실행합니다.
   2. 리간드에 대한 참조 실험을 얻기 위해 두 모세관에서 원하는 농도의 리간드를 포함하는 작업 버퍼로 3.1 - 3.1.1단계를 반복합니다(각각 120초 및 600초의 고온 평형 시간을 사용하여 두 개의 별도 실험을 수집하여 열불안정 리간드 변환을 위한 속도 상수를 획득하는 데 사용).
      메모: 여기에 사용된 스캔 속도는 후속 실험에서 생체 분자가 정방향 및 역방향 스캔에서 열 평형 상태에 있는지 확인합니다. 0.1 - 0.2 °C min-1< 스캔 속도는 서모그램에 잡음이 발생하며 DSC 실험에는 적용할 수 없습니다. 온도는 유리 생체 분자의 용융 온도보다 훨씬 낮은 온도에서 리간드 포화 생체 분자의 용융 온도(MN4의 경우 ~ 20 - 80 °C)까지 확장되어야 합니다. 스캔의 재현성을 확인합니다(예: 총 20개의 정방향 스캔 10회 및 10회의 역방향 스캔으로 충분함).
   3. 여러 리간드(예: 코카인 및 퀴닌)를 사용하는 경우 모세혈관에서 리간드를 제거하고 교차 오염을 방지하기 위해 실행 사이에 200mL의 작업 버퍼(2.5단계부터 반복)로 DSC를 플러시합니다.
      메모: 이전 리간드가 모세관 벽에 강하게 흡착되고 완충액 플러싱으로 적절하게 제거되지 않았는지 확인하기 위해 리간드 결합 실행 후 유리 생체 분자에 대한 복제 실험을 수행하는 것이 도움이 됩니다. 리간드 결합 실험 후 유리 생체 분자에 대한 서모그램이 더 큰 크기와 더 높은 변성 온도로 이동하는 것처럼 보이면 이전 리간드가 플러싱 후에도 열량계에 여전히 존재할 가능성이 있습니다. 플라스틱 캡과 압력 손잡이를 끈 상태에서 60°C에서 1시간 동안 20% Contrad-70으로 모세관을 배양하여 흡착된 리간드를 제거합니다. DSC 소프트웨어의 Experimental Method 탭에서 Experimental Mode를 "Isothermal"로 변경합니다. 지속 시간으로 3,600초를 선택하고 등온 온도로 60°C를 선택하고 평형 시간으로 0을 입력합니다. "Add to Experimental Method"를 클릭합니다. 등온 실험이 화면 하단에 나타납니다. 완료 후 2L의 탈이온수로 기기를 세척하고 2.5단계부터 반복합니다.
2. 기준 스캔과 동일한 DSC 로딩 절차 및 실험 파라미터를 사용하여 샘플 실험을 실행합니다. 유리 생체 분자 데이터 세트의 경우, 참조 모세관에는 작동 완충액이 포함되어 있고 샘플 모세관에는 작동 완충액에서 원하는 농도의 유리 생체 분자가 포함되어 있는지 확인합니다.
   1. 리간드 결합 실험의 경우, 리간드가 기준 모세관의 작동 완충액에 있고 생체 분자와 리간드가 샘플 모세관의 작동 완충액에 있는지 확인합니다. 2.5단계에서와 같이 서로 다른 리간드를 추가하는 사이에 시스템을 플러시합니다.
3. 고온 평형 주기가 600초로 증가하고 다른 모든 실험 파라미터가 3.2.1.
   단계와 동일한 열불안정 리간드에 결합된 생체 분자로 한 번의 추가 실험을 수행합니다. 메모: 두 번째 리간드 결합 실험에 대한 고온 평형 기간의 지속 시간은 짧은 평형 시간 실험보다 리간드가 더 빨리 고갈되도록 하기 위해 간단히 선택됩니다. 첫 번째 실험에서 리간드 결합 피크가 스캔 수의 함수로 천천히 감소하는 경우(예: 연속 피크 최대값의 차이가 0.5°C≤ 경우), 두 번째 실험에서 리간드를 적절하게 고갈시키기 위해 고온 평형 기간이 10배에서 20배 증가할 것으로 추정합니다. 리간드 변환에 대한 속도 상수를 정확하게 계산하려면 두 번째 실험에서 첫 번째 실험에 비해 리간드가 더 빨리 고갈되어야 합니다. 두 실험의 전체 분석에서 추출된 리간드 농도는 유사하므로 두 번째 실험에서 리간드 고갈이 충분히 가속화되지 않으면 사용할 수 없습니다.

4. 데이터 처리

1. DSC 데이터 분석 소프트웨어에서 DSC 실험 파일을 열고(재료 표 참조) 원시 전력 데이터를 스프레드시트로 내보냅니다.
2. 데이터 피팅을 위해 원시 전력 데이터가 포함된 스프레드시트를 소프트웨어로 가져옵니다.
3. 기준선은 자유 및 리간드 결합 생체 분자 실험에서 버퍼 전력 데이터를 빼서 샘플 데이터를 뺍니다.
   메모: 열불안정 리간드 실험의 경우, 초기 리간드의 농도는 스캔할 때마다 감소합니다. 따라서 샘플 스캔 1에서 버퍼 스캔 1을 빼는 것이 이상적입니다. 우리는 코카인을 사용한 버퍼 스캔이 리간드 변환이 진행됨에 따라 눈에 띄게 변하지 않는다는 것을 발견했으며, 따라서 단일 열불안정 리간드 버퍼 스캔을 사용하여 모든 열불안정 리간드 결합 데이터를 뺄 수 있습니다.
4. 기준선에서 뺀 샘플 전력 데이터를 열 용량으로 변환합니다.
   메모: 전환에는 추정할 수 있는 생체 분자의 부분적인 비부피가 필요합니다.

5. 데이터 분석

1. 짧은 평형 시간 열불안정 리간드 결합 열 용량 데이터 세트를 단일 세트의 기준선, 리간드 농도, 접힘 및 리간드 결합 매개변수로 전역적으로 맞춥니다.
2. 열불안정 리간드 변환에 대한 속도 상수를 계산하기 위해 긴 평형 시간 데이터셋에 대해 전역 피팅을 반복합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
소금	켐 임펙스	#00829
인산나트륨 일염기성 이수화물	시그마 알드리치	71502
인산나트륨 이염기성	시그마 알드리치	S9763
분자 생물학을 위한 탈이온화된 물	밀리포어	H20MB1001
0.2미크론 멸균 주사기 필터	폭스바겐	CA28145-477
3 kDa 원심 필터	밀리포어	UFC900324
투석 튜브 0.5-1.0 kDa 컷오프	스펙트럼 연구소	131048
실리콘 튜빙	폭스바겐	89068-474
플라스틱 DSC 플랜지 캡	TA 기기	6111
DNA 압타머 MN4	통합 DNA 기술	https://www.idtdna.com/site/order/menu
코카인	시그마 알드리치	C008
말라리아	시그마 알드리치	22620
NanoDSC-III 미세 열량계	TA 기기	http://www.tainstruments.com/nanodsc/
DSCRun 소프트웨어	TA 기기	http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/
NanoAnalyze 소프트웨어	TA 기기	http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/
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