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1. Competition Binding Assay를 위한 CXCL12, Assay Buffer 및 Jurkat 세포 준비
- 동결건조된 시약(-80°C에서 보관, 어두운 곳에서 보관)을 폴리소르베이트 20 0.01%(부피/부피)가 보충된 초순수에 용해시켜 CXCL12AF647(20μg/mL, 재료 및 시약표 참조)의 원액을 준비합니다. 이 원액의 일회용 부분 표본은 -80 °C에서 빛을 차단하여 보관하십시오.
- 200mL Hank's Balanced Salt Solution(HBSS, 10x, 페놀 레드 미포함 및 중탄산나트륨 미포함, 1x 최종 농도)에 40mL HEPES(1M, 20mM 최종 농도)를 첨가하여 분석 완충액을 준비합니다. 초순수를 첨가하여 최종 부피 2L를 얻습니다.4g(중량/부피 0.2%) 소 혈청 알부민(BSA)을 추가하고 자기 교반을 통해 BSA를 용해합니다. 마지막으로 pH를 7.4로 조정하고(이를 위해 NaOH 사용) 진공 매니폴드를 사용하여 0.2μm 공극(재료 및 시약 표 참조)을 통해 용액을 여과합니다.
참고: 이 분석 버퍼는 프로토콜의 모든 추가 단계에서 사용됩니다.
- Jurkat 세포의 수와 생존 능력을 세십시오. 이를 위해 세포 현탁액의 샘플을 채취하여 인산염 완충 식염수(PBS)로 희석합니다.
메모: 당사는 다양한 농도에서 세포 현탁액을 계수할 수 있는 자동화된 세포 생존도 분석기(재료 및 시약 표 참조)를 일상적으로 사용합니다. 세포 계수의 경우 0.5mL의 세포 현탁액을 1.5mL PBS로 희석합니다(다른 희석, 예: 1.9mL PBS에서 0.1mL도 가능). 똑같이 잘 작동해야 하는 세포 수와 생존 가능성을 계산하기 위해 여러 다른 장치가 상업적으로 이용 가능합니다.
- 원심분리(즉, 하나의 완전한 96웰 플레이트로 분석을 실행하기 위한 ~24 x 106 세포)를 400 x g에서 RT에서 5분 동안 원심분리(사용된 원심분리기 유형은 재료 및 시약 표 참조)로 멸균 50mL 튜브에 모읍니다.
- 세포 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 부드럽게 붓습니다. 새로운 분석 버퍼(예: 20mL)를 추가하고 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 세포를 재현탁합니다.
- 실온에서 5분 동안 400 x g에서 세포를 다시 원심분리합니다.
- 상층액을 다시 붓고 세포 펠렛을 새로운 분석 버퍼에 재현탁하여 5 x 106 cells/mL의 밀도를 얻습니다.
2. 경쟁 결합 분석
참고: 실제 경쟁 결합 분석은 RT에서 수행되며 비멸균 조건에서 수행할 수 있습니다.
- 조사 중인 화합물을 분석 완충액(1.2 참조)에 희석하여 원하는 농도를 얻습니다. 초기 스크리닝을 위해 고정된 농도의 화합물(예: 10μM 최종 농도)을 준비하거나, 화합물의 보다 상세한 특성 분석을 위해 연속 희석 계열의 농도를 준비합니다(예: 1μM, 최종 농도에서 시작하는 1/3, 1/4 또는 1/5 희석 계열). 화합물 용액은 궁극적으로 분석에서 2배 희석된다는 점을 명심하십시오. 따라서 2X 농축 용액을 준비하십시오.
- 사전 정의된 실험 레이아웃(예: 그림 1C)에 따라 100μL의 복합 용액(2x 농축)을 투명한 96웰 원형 바닥판(재료 및 시약 표 참조)에 분배합니다.
참고: 이 단계에서는 음성 및 양성 대조군 샘플이 분석에 포함됩니다. 음성 대조군 샘플에서는 화합물 대신 100μL의 분석 버퍼가 96웰 플레이트의 웰에 추가됩니다. 양성 대조군 샘플의 경우 이 단계에서 분석 버퍼도 추가됩니다. 여러 화합물의 희석 시리즈를 테스트하는 일반적인 실험 레이아웃에 대해서는 그림 1C를 참조하십시오.
- 멀티채널 피펫을 사용하여 시약 저장소에서 50μL의 세포 현탁액(1.7; 0.25 x 106 세포 참조)을 96웰 플레이트에 추가합니다. 어둠 속에서 RT에서 15분 동안 플레이트를 배양합니다.
- 유사한 시약 저장용기에서 형광 표지된 CXCL12 50μL(즉, 분석 완충액 내 CXCL12AF647 100ng/mL, 4배 농축, 최종 농도 25ng/mL)를 96웰 플레이트의 웰에 추가합니다. 어둠 속에서 RT에서 30분 동안 배양합니다.
메모: negative control 샘플의 경우 대신 assay buffer를 추가하십시오. 따라서 음성 대조군 샘플에서 감지된 형광 신호는 자가형광 배경 신호와 일치합니다(그림 1A). 양성 대조군 샘플의 경우 CXCL12AF647의 50μL/웰을 추가합니다. 양성 대조군 샘플은 화합물을 사용한 사전 배양에 의한 잠재적 억제가 포함되지 않았기 때문에 감지된 최대 형광 신호를 생성합니다(그림 1A).
- 96웰 플레이트를 400 x g에서 RT에서 5분 동안 원심분리합니다.플레이트를 뒤집어 펠릿화된 세포에서 상층액을 제거합니다. 티슈에 접시를 말리십시오.
- 멀티채널 피펫을 사용하여 시약 저장고에서 웰로 200μL의 새로운 분석 완충액을 추가합니다. 즉시 진행하십시오.
- RT에서 400 x g로 5분 동안 플레이트를 다시 원심분리합니다. 플레이트를 뒤집어 상층액을 제거하고 티슈에서 다시 건조시킵니다.
- PBS에 용해된 200μL의 1% 파라포름알데히드에 세포 펠릿을 부드럽게 재현탁합니다. 이 단계는 셀을 수정합니다.
- 유세포 분석법을 통한 형광의 정량화로 즉시 프로토콜을 계속하십시오.
3. 유세포 분석을 통한 시료 분석
CXCL12AF647 염색 및 고정 세포는 이제 유세포 분석을 사용하여 분석할 준비가 되었습니다. 여러 유형의 유세포 분석기를 사용할 수 있지만 여기를 위한 올바른 레이저(즉, 적색 레이저, 여기 범위 ~630nm)와 형광단 검출에 적합한 필터(방출 필터 ~660nm)를 장착해야 합니다. 96웰 플레이트 형식의 시료를 처리할 수 있어야 합니다. 적합한 유세포 분석 장치의 예는 Table of Materials and Reagents에 나와 있습니다.
- 장치를 시작하고 해당 소프트웨어를 엽니다(재료 및 시약 표 참조).
- 도트 블롯 형식으로 시각화할 세포 매개변수를 선택합니다: 전방 산란(FSC), 측면 산란(SSC) 및 형광단(CXCL12AF647) 검출 채널.
메모: FSC 매개변수를 사용하면 감지된 광 흡수가 세포의 직경에 비례하기 때문에 세포를 크기에 따라 구별합니다. 90° 각도에서 광 산란을 측정하는 SSC 매개변수는 셀의 입도에 대한 정보를 제공합니다.
- 하나의 샘플(예: 음성 대조군 샘플)을 선택하여 FSC 및 SSC 매개변수를 기반으로 정의된 동질성 세포 집단의 게이팅을 수행합니다.
- 이 negative control 샘플에서 ~100 μL의 고정된 세포를 유세포분석기로 자동 주입하도록 선택합니다. 주입 전에 "mixing" 옵션을 선택하고 1.5μL/s의 시료 유속을 사용합니다.
- "데이터 획득"을 선택하여 이 샘플을 실행합니다. 이제 이 샘플에 대한 FSC 및 SSC 매개변수가 화면에 나타납니다.
- 소프트웨어의 게이팅 도구를 선택합니다. FSC 및 SSC 도트 블롯 시각화를 기반으로 게이팅을 통해 균질하고 생존 가능한 세포 집단을 미리 정의합니다. 이렇게 하려면 이 두 차원을 기반으로 균일하게 분포된 단일 셀("이벤트")을 포함하는 폴리곤을 만듭니다(소프트웨어의 게이팅 도구 사용).
메모: 게이팅 절차는 추가 분석에 사용될 균질하고 생존 가능한 세포 집단을 정의하는 것을 목표로 합니다. 게이팅은 대부분의 생존 가능한 세포가 FSC 및 SSC 매개변수를 기반으로 동질적인 세포 집단을 형성할 것이라는 가정에 의존합니다. 이 단계를 수행하면 세포 파편, 죽은 세포 및 세포 응집체를 추가 분석에서 크게 제외할 수 있습니다. 게이팅 프로세스의 그림이 그림 1B에 나와 있습니다.
- 샘플당 20,000개의 "이벤트"(즉, 단일 세포)를 분석하려면 선택합니다.
메모: 이는 각 샘플에 대해 사전 정의된 게이트 내에 있는 20,000개의 세포가 최종적으로 분석된다는 것을 의미합니다. 각 샘플에 대한 데이터 수집은 이 수의 이벤트가 분석될 때까지 계속됩니다.
- 실행을 시작합니다("데이터 기록" 선택). 유세포 분석 장치는 이제 각 샘플에 대한 평균 형광 강도(MFI)를 기록하여 모든 샘플을 하나씩 분석합니다. 이 MFI는 사전 정의된 게이트 내에 속하는 20,000개의 세포에 해당하는 평균 형광 신호에 해당합니다.
