BW 세포의 수용체-리간드 상호작용을 연구하기 위한 ELISA 기반 Reporter Assay

초록

출처: Elias, S. et al., 수용체-리간드 상호 작용 연구를 위한 BW 리포터 시스템. J. Vis. 특급 (2019)

이 비디오는 수용체-리간드 상호 작용의 리포터 분석 기반 검출을 보여줍니다. 성공적인 수용체-리간드 상호 작용은 다운스트림 신호 경로를 활성화하여 용액에서 분비 리포터 분자로 사이토카인의 생성 및 방출을 유발하며, 이는 ELISA를 사용하여 확인됩니다.

프로토콜

1. 키메라 구조체를 표현하는 플라스미드의 생성

참고: 목표는 마우스 CD3ζ 사슬의 막관통 및 세포 내 도메인에 융합된 관심 수용체의 세포 외 도메인을 발현하는 플라스미드를 생성하는 것입니다(그림 1A).

1. 신호 펩타이드를 포함하는 관심 수용체의 세포외 도메인의 염기서열을 검색합니다. 이 수용체를 발현할 것으로 예상되는 DNA 물질(예: cDNA 또는 플라스미드)을 얻습니다.
2. 마우스 CD3ζ 사슬의 막관통 및 세포 내 도메인을 발현하는 DNA 물질(예: cDNA 또는 플라스미드)을 얻습니다.
3. 그림 1A에 표시된 일반적인 구조를 기반으로 융합 단백질의 염기서열을 설계합니다. 전체 염기서열이 동일한 코돈 판독 프레임 내에 있는지 확인합니다. 이 순서는 적절한 프라이머를 설계하고 최종 제품을 검증하는 데 사용됩니다.
4. 융합 단백질의 각 단편을 개별적으로 증폭하도록 두 개의 PCR 반응을 설계합니다(그림 1B, 1C).
   메모: PCR 반응에 대한 특정 조건(예: 연신율 시간 및 어닐링 온도)은 특정 수용체를 위해 설계된 프라이머의 특성에 따라 다릅니다.
   1. 수용체의 세포외 분절을 증폭합니다.
      1. 수용체의 신호 펩타이드의 일부, Kozak 합의 염기서열 및 적절한 제한 부위를 포함하는 5' 프라이머를 설계합니다(그림 1B).
      2. 융합 단백질의 양쪽 부분을 둘러싸는 3' 프라이머를 설계합니다(그림 1B). 예를 들어, 초기 설계의 경우, 이 3' 프라이머는 수용체의 세포외 분절의 마지막 20개 염기쌍과 CD3ζ 분절의 처음 9개 염기쌍을 포함할 수 있습니다.
         메모: 이 프라이머는 융합 서열을 생성하는 데 사용되며 ligation에 사용되지 않기 때문에 3' 프라이머에 제한 부위를 추가할 필요가 없습니다.
   2. CD3ζ 세그먼트를 증폭합니다.
      1. 융합 단백질의 양쪽 부분을 둘러싸는 5' 프라이머를 설계합니다(그림 1C). 예를 들어, 초기 설계의 경우, 5' 프라이머는 수용체의 세포외 분절의 마지막 9개 염기쌍과 CD3ζ 분절의 처음 20개 염기쌍을 포함할 수 있습니다.
         메모: 이 프라이머는 융합 서열을 생성하는 데 사용되며 접합에 사용되지 않기 때문에 5' 프라이머에 제한 부위를 추가할 필요가 없습니다.
      2. CD3ζ 염기서열의 말단과 적절한 제한 부위를 포함하는 3' 프라이머를 설계합니다(그림 1C).
   3. 어닐링 온도가 각 쌍에서 유사하도록 이 두 반응 각각에서 프라이머 서열을 수정하십시오(융합 단백질의 두 부분의 서열을 포함하는 프라이머는 각 반응에서 서열의 일부로만 어닐링됨).
5. 처음 두 반응의 PCR 산물의 혼합물을 세포 외 수용체 세그먼트의 5' 프라이머(단계 1.4.1.1) 및 CD3ζ 세그먼트의 3'(단계 1.4.2.2)과 함께 DNA 템플릿으로 사용하는 추가 PCR을 수행합니다(그림 1D). 이 반응은 최종 융합 서열을 생성해야 합니다.
6. 복제를 위해 평소와 같이 진행합니다.
   1. 최종 PCR 산물을 타겟 cut vector(타겟 벡터는 일반적으로 G418 및 암피실린 내성을 발현하는 pcDNA3임)에 접합합니다.
   2. 결찰된 벡터를 수용성 박테리아로 변환합니다.
      1. 유능한 박테리아 50μL를 얼음에서 해동합니다.
      2. 박테리아에 접합 벡터를 추가하고 얼음 위에서 20분 동안 배양합니다.
      3. 42 °C에서 45 초 동안 배양합니다.
      4. 항생제 없이 200μL의 LB를 추가합니다.
      5. 37 °C에서 1 시간 동안 연속 흔들어 배양합니다.
      6. 적절한 항생제(예: 최종 농도가 0.1mg/mL인 암피실린 용액)가 든 LB 플레이트에 씨앗을 뿌립니다.
   3. 5mL의 LB(15mL 튜브)에서 여러 박테리아 콜로니를 수집하고 성장시킵니다.
   4. 다음 날, mini-prep kit로 플라스미드를 추출합니다.
   5. 제한 효소로 유전자 삽입물을 분석합니다.
   6. 관련 콜로니의 염기서열을 분석하고 염기서열과 판독 프레임이 올바른지 확인합니다(1.3단계에서 참조).
7. 검증된 플라스미드를 유능한 박테리아로 전환시킵니다.
   1. 유능한 박테리아 20μL를 얼음에서 해동합니다.
   2. 박테리아에 1μL의 플라스미드를 첨가하고 얼음에서 20분 동안 배양합니다.
   3. 42 °C에서 45 초 동안 배양합니다.
   4. 항생제 없이 200μL의 LB를 추가합니다.
   5. 37 °C에서 1 시간 동안 연속 흔들어 배양합니다.
   6. 적절한 항생제(예: 최종 농도가 0.1mg/mL인 암피실린 용액)가 포함된 박테리아 성장 플레이트에 씨앗을 뿌립니다.
8. 다음 날, 0.1mg/mL 암피실린(~250mL)이 들어 있는 큰 LB 용기에서 박테리아 군집을 성장시킵니다.
9. 다음 날, kit.
   에서 제공하는 특정 지침에 따라 맥시 준비를 수행합니다. 메모: 전기천공법(electroporation) 절차를 위해서는 아래와 같이 많은 양의 플라스미드가 필요합니다.

2. 키메라 단백질을 BW 세포로 발현하는 플라스미드의 형질주입

참고: transfection을 위해 다양한 방법을 사용할 수도 있습니다(예: 렌티바이러스 감염). 전기천공을 하기 전에 아래와 같이 DNA의 에탄올 침전을 수행합니다. 다음 단계에서는 멸균 상태가 필요합니다.

1. 전날, BW5147 세포("BW 세포")를 전기천공을 위해 준비합니다. 10% 태아 송아지 혈청(FCS), 1% 피루브산 나트륨, 1% L-글루타민, 1% 비필수 아미노산 및 1% 페니실린-스트렙토마이신("완전 배지")이 보충된 RPMI가 포함된 10mL의 100,000 BW5147 세포/mL(즉, 총 10 x 10⁶개 세포)가 포함된 플레이트 10(10cm).
2. 융합 단백질을 발현하는 pcDNA3 플라스미드 100 μg을 1.5-2 mL 튜브에 넣고 pH 5.3-5.5의 아세트산 나트륨 3 M을 첨가합니다. 아세트산 나트륨의 부피는 100 μg 플라스미드 부피의 0.1 (10 %)에 해당해야합니다. NaOH 또는 HCl을 첨가하여 pH 측정기로 아세트산나트륨의 pH를 적정합니다.
3. 2.2 단계에서 설명한 대로 플라스미드와 아세트산 나트륨의 혼합물에 2.5 부피의 100% 에탄올을 추가합니다(플라스미드 및 아세트산 나트륨의 총 부피의 2.5배). -20 °C에서 하룻밤 동안 또는 70 °C에서 2 시간 동안 배양하십시오.
4. BW 세포를 플레이팅한 후 24시간 후에 모든 BW 세포(~100mL)를 2개의 50mL 튜브에 수집합니다. 515 x g에서 5분 동안 세포를 원심분리하고 상층액을 버립니다.
5. 단일 50mL 튜브에 25mL의 RPMI-로 두 튜브의 펠릿을 재현탁합니다. 예를 들어, 한 튜브의 펠릿을 25mL의 RPMI-로 재현탁한 다음 이 유체를 사용하여 다른 50mL 튜브에 유체를 다시 현탁시켜 BW 세포의 총 펠릿이 단일 튜브의 25mL 배지에 다시 현탁되도록 합니다.
   메모: 매체는 혈청이 electroporation를 방해하기 수 있기 때문에 첨가물이 없어야 합니다.
6. 515 x g에서 5분 동안 세포를 다시 원심분리합니다. 펠릿을 1mL의 RPMI에 재현탁시키고 내용물을 얼음 위의 0.4cm 큐벳에 옮깁니다.
7. 에탄올 침전(단계 2.3)을 거친 플라스미드를 16,000 x g 및 4°C에서 30분 동안 원심분리합니다.
8. 1mL의 70% 에탄올과 원심분리기로 한 번 세척하고 16,000 x g 및 4°C에서 20분 더 세척합니다(소금을 씻어내기 위해).
9. 모든 에탄올을 제거하고 펠릿을 약간 건조시킵니다(즉, 조직 배양 후드의 열린 튜브에서). 이전에 60°C로 가열된 100μL의 RPMI로 펠릿을 재현탁합니다.
10. 다시 부유한 플라스미드(Step 2.8)를 큐벳의 세포에 추가하고 얼음 위에서 5분 동안 배양합니다.
11. 0.23kV, 250 용량으로 셀을 전기천공합니다. 이 작업은 ~4ms가 소요됩니다.
12. 전기천공된 세포를 50mL 튜브로 옮기고 50mL의 완전한 배지를 첨가한 다음 5,15 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.
13. 상등액을 버리고 50mL의 완전한 배지로 세포를 다시 현탁시킵니다.
14. 전기천공된 세포를 24웰 배양 접시(웰당 1mL, 총 ~50웰)에 플레이트화하고 37°C 및 5% CO₂에서 48시간 동안 배양합니다.
15. 항생제가 투여된 형질주입된 세포를 선택합니다. 48시간 후 각 웰에 10mg/mL G418이 보충된 완전한 배지 1mL를 추가합니다(이 단계에서 각 웰의 최종 부피는 2mL이고 각 웰에서 G418의 최종 농도는 5mg/mL임).
    메모: 플라스미드에 다른 항생제 내성이 포함되어 있는 경우, 이 단계 전에 형질 주입되지 않은 BW 세포를 사멸하는 데 필요한 항생제 농도를 측정합니다.
16. 매 48시간마다 웰에서 배지를 교반하지 않고 각 웰의 상위 부피 1mL를 조심스럽게 버립니다(BW 세포는 웰 바닥에 있는 경향이 있음). 각 웰에 5mg/mL G418이 보충된 완전한 배지를 추가하여 각 웰의 최종 부피가 다시 2mL가 되도록 합니다.
17. 모든 웰에서 세포 성장에 대한 배양 플레이트를 정기적으로 검사합니다.
    메모: 매체의 색상을 노란색으로 변경하면 성장하는 세포를 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다. 그러나 처음에는 G418 자체 때문에 매체가 노란색이 됩니다. positive wells(세포가 성장하는 well)를 식별합니다. 이 웰은 G418에 내성이 있으므로 융합 단백질을 발현할 것으로 예상됩니다. 이 과정은 일반적으로 ~3주가 소요됩니다.

3. positive wells의 세포에서 transfected receptor의 발현 검증.

1. 형질주입된 BW 세포를 형질주입된 수용체에 대해 특정 항체로 염색합니다.
2. 유세포 분석에 의한 수용체의 발현 수준을 대조 세포(transfected 되지 않은 BW 세포)의 발현과 비교합니다.
3. 하나 이상의 웰을 검증한 후 실험 목적으로 세포를 즉시 사용하거나, 배양에서 성장시키거나, 향후 응용 분야를 위해 동결합니다.
4. 새로운 실험을 수행하기 전에 transfection된 수용체의 발현을 확인합니다. 몇 주간의 성장 후, 안정적인 수용체 발현을 가진 G418을 가진 세포, G418은 배양 배지에서 생략 할 수 있습니다.

4. target이 있는 transfection된 BW 세포의 배양

참고: 형질주입된 BW 세포를 처음으로 사용하는 경우, 관심 수용체의 알려진 리간드를 발현하는 표적 또는 관심 수용체에 대해 특이적으로 지시된 플레이트 결합 항체에 대해 테스트하는 것이 바람직합니다(가교 결합 실험, 아래 섹션 4.2.1.3 참조).

1. 바람직하게는, 실험 24시간 전에 BW 세포를 분리한다(예를 들어, 새로운 10cm 배양 플레이트에서 배양 중인 세포 2mL에 완전한 배지 10mL를 첨가함으로써).
2. 형질주입된 BW 세포를 표적과 함께 배양합니다. 빈 벡터를 발현하는 대조군 BW 세포(또는 부모 BW 세포)에 대해 동시에 실험을 수행합니다. 96F 플레이트가 선호됩니다(그러나 96U 플레이트도 사용할 수 있음). 실험을 세 번으로 수행합니다. 완전한 배지의 모든 세포를 현탁시킵니다.
   1. 대상을 준비합니다. 표적의 유형은 목적의 기능에 따라 다르며 세포, 항체로 사전 배양된 세포 또는 항체 단독일 수 있습니다. 이 시스템은 박테리아를 표적으로 사용되기도 했습니다.
      1. 표적이 분열하는 세포(즉, 세포주)인 경우 분석 전에 6,000rad로 조사합니다. 50,000개의 표적 세포를 96개 플레이트의 단일 웰(100μL 부피)에 배치합니다.
      2. 인간 FcγR을 발현하는 항체 및 BW 세포를 사용한 실험의 경우, 96웰 플레이트에서 얼음 위에 항체와 함께 표적 세포를 배양합니다(예: 표적 세포 50μL 및 항체 50μL, 다양한 항체 투여량을 테스트할 수 있음).
      3. 항체만 표적으로 사용하는 경우(가교 실험) 플레이트에 결합해야 합니다. 이를 위해 먼저 37°C 및 5% CO₂에서 1-2시간 동안 96F 플레이트의 완전한 배지에서 항체를 배양합니다(일반적인 시작 용량은 50μL에서 특정 항체 0.5μg임). 플레이트를 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거합니다.
         메모: 이 경우, 96F 플레이트는 항체를 플레이트에 결합할 수 있게 하며, 이는 형질주입된 BW 세포의 첨가 후 형질주입된 수용체의 활성화로 이어질 것입니다.
   2. BW 셀(이펙터 셀)을 추가합니다. 50,000개의 BW 세포를 96개 플레이트의 단일 웰(100μL 부피)에 배치합니다.
   3. 필요한 경우 각 웰의 부피를 200μL로 채웁니다.
   4. 플레이트를 37 ° C 및 5 % CO₂에서 48 시간 동안 배양합니다 (이 기간은 보정 할 수 있음).
3. 48시간 후 플레이트를 -20°C에서 동결하고 ELISA를 사용하기 전에 해동하거나 ELISA에 즉시 사용하십시오(다음 단계 참조).

5. 엘리사

1. ELISA 플레이트를 항마우스 IL-2 항체(anti-mIL-2)로 코팅합니다. 웰당 50μL의 1x PBS(인산염 완충액 식염수) 부피에 0.05μg의 anti-mIL-2를 배치합니다. 코팅된 ELISA 플레이트를 항-mIL-2 항체와 함께 4°C에서 하룻밤 동안 또는 37°C에서 2시간 동안 배양
   메모: 배양 단계 직후 ELISA를 수행하려면 BW 세포의 배양 기간이 끝나기 24시간 전에 ELISA 플레이트를 코팅해야 합니다.
2. ELISA 플레이트의 유체를 버리고 1x PBS와 1% 소 혈청 알부민(BSA)으로 구성된 차단 용액(웰당 200μL)을 추가합니다. ELISA 플레이트를 실온에서 2시간 동안 배양합니다.
3. ELISA 플레이트를 0.05% PBS 트윈 용액(즉, 1x PBS 1리터에 0.5mL의 Tween-20)으로 세 번 세척합니다.
4. 표적(4.3)과 함께 배양된 BW 세포가 있는 96 플레이트를 예로 들어 보겠습니다. 플레이트가 얼면 완전히 해동합니다(예: 37°C에서 짧은 배양으로). 96웰 플레이트(5분, 515 x g)를 원심분리하고 각 웰에 있는 100μL의 상층액을 사전 코팅 및 차단된 ELISA 플레이트로 조심스럽게 옮깁니다.
   메모: 상등액은 세포를 복용하지 않도록 각 웰의 측면에서 수집해야 합니다.
5. 원하는 경우, 코팅된 ELISA 플레이트의 빈 열 중 하나에 정의된 농도의 재조합 mIL-2를 추가하여 mIL-2의 표준 곡선을 생성합니다. 예를 들어, 2,500pg/mL의 mIL-2 농도에서 시작하여 각 후속 웰에서 50%씩 감소합니다. 마지막 웰에 mIL-2를 첨가하지 마십시오.
6. ELISA 플레이트를 4°C에서 하룻밤 동안 또는 37°C에서 2시간 동안 배양합니다.
7. PBS 트윈으로 ELISA 플레이트를 네 번 세척합니다.
8. 비오틴 anti-mouse IL-2를 ELISA 플레이트에 추가합니다. 1% BSA가 포함된 1x PBS 1mL에 1μg 항체 농도를 사용하고 웰당 100μL로 나눕니다.
9. 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
10. PBS 트윈으로 ELISA 플레이트를 6번 세척합니다.
11. HRP 복합 스트렙타비딘을 추가합니다. 1% BSA와 함께 PBSX1 1mL에 1μL 스트렙타비딘 농도를 사용하고 웰당 100μL로 나눕니다.
12. 실온에서 30분 동안 배양합니다.
13. PBS 트윈으로 ELISA 플레이트를 6번 세척합니다.
14. TMB 기질 용액의 웰당 100μL를 추가합니다. TMB를 추가할 때 시간 지연으로 인한 웰 간의 차이를 최소화하기 위해 이 단계를 빠르게 완료하십시오.
15. 650nm에서 ELISA 플레이트 리더로 ELISA 플레이트를 읽습니다(신호가 약한 경우 판독을 반복할 수 있음).

결과

그림 1: 키메라 수용체-CD3ζ의 구조와 PCR 프라이머의 설계. (A) 마우스 CD3ζ의 막관통 및 세포내 도메인에 융합된 세포외 수용체의 일반적인 구조. (B) 수용체의 세포외 도메인은 CD3ζ의 뉴클레오티드를 포함하는 3' 프라이머로 증폭되었습니다. (C) CD3ζ의 세포내 및 막관통 도메인은 수용체 뉴클레오티드도 포함하는 5' 프라이머로 증폭되었습니다. (D) 최종 PCR 반응에서, 서열이 중복되는 두 분절을 DNA 주형으로 사용하였다. 모든 그림 패널에서 서로 다른 단백질 도메인은 색상으로 구분되고 파란색 직사각형(CD3ζ 서열)과 빨간색 직사각형(수용체 서열)으로 상자에 표시됩니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
AccuPrep, 플라스미드 미니 추출 키트	바이오니아	케이-3030
안티 마우스 IL-2	바이오레전드	503702
비오틴 안티 마우스 IL-2	바이오레전드	503804
ELISA 플레이트	디그루트	전화: 60-655061
소 태아 세럼	시그마	F7524-500ml
G418	수성	MBS3458105GM
유전자 펄서 II	바이오 라드	165-2105, 165-2106, 165-2107, 165-2108, 165-2109, 165-2110
L-글루타민	생물 산업	03-020-1B
MEM 비필수 아미노산 용액	생물 산업	01-340-1B
페니실린-스트렙토마이신 용액	생물 산업	03-031-1B
과산화효소 스트렙타비딘	잭슨 이뮤노리서치	TEL:016-030-084
PureLink HiPure 플라스미드 필터 Maxiprep 키트	써모피셔 사이언티픽	K210016
RPMI-1640 미디엄	생물 산업	2001년 30월 30
나트륨 피루브산	생물 산업	03-042-1B
티엠비	서던바이오테크	제0410-01

일 호