$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. 인간 적혈구 분리, 비오틴화(Biotinylation) 및 삼투압 조절
참고: 1.1단계는 간호사와 같은 훈련된 의료 전문가가 기관 검토 위원회에서 승인한 프로토콜에 따라 수행해야 합니다.
- 손가락으로 찌르는 혈액에서 8-10 μl(한 방울)의 혈액을 얻어 1 ml의 탄산염/중탄산염 완충액에 첨가합니다(재료 목록). 혼합물을 부드럽게 와류 또는 피펫으로 가열하고 900 x g에서 1분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버리고 한 번 더 씻으십시오.
- 작은 비커에 3.5-4mg의 비오틴-PEG3500-NHS 링커를 무게를 싣습니다(재료 목록). 탄산염/중탄산염 완충액에 용해시켜 최종 농도를 3mg/ml로 만듭니다.
- 171μl의 탄산염/중탄산염 완충액, 10μl의 RBC 팩 및 1049μl의 Biotin-PEG3500-NHS 링커 용액을 혼합하고 RT에서 30분 동안 배양합니다. RBC를 탄산염/중탄산염 완충액으로 한 번 세척한 다음 N2-5% 완충액으로 두 번 세척합니다(재료 목록).
- 한편, 바닥에 건조제를 채운 유리 진공 데시케이터에 캡이 헐거워진 링커 병을 놓고 5분 동안 진공 청소기로 청소한 후 데시케이터에 아르곤을 채웁니다. 뚜껑을 조이고 병을 꺼냅니다. 플라스틱 파라핀 필름(재료 목록)으로 병을 밀봉하고 바닥에 건조제를 채운 용기에 넣고 -20°C에서 보관합니다.
메모: 1.2-1.4(1.3의 배양 및 세척 제외)를 포함한 Biotin-PEG3500-NHS 링커의 사용과 관련된 단계는 가능한 한 빨리 수행해야 합니다.
- 니스타틴을 N2-5% 완충액으로 희석하여 최종 농도 40μg/ml를 만듭니다. 5μl의 비오틴화된 적혈구와 71.4μl의 니스타틴(재료 목록) 용액을 혼합하고 0°C에서 1시간 동안 배양합니다. N2-5% 완충액으로 두 번 세척하고 N2-5% 완충액 + 0.5% BSA(재료 목록)와 함께 냉장고(4°C)에 보관합니다.
2. 유리 구슬 실란화
- 비드 표면 세척
- 유리 구슬 가루 50mg의 무게를 달아 500μl의 DI 물에 다시 현탁시킵니다.
- 50ml 비이커에 0.5ml의 30% H2O2(재료 목록)와 9.5ml의 DI 물을 혼합한 다음 2ml의 농축 NH4OH(재료 목록)를 추가하고 이 용액을 핫 플레이트의 보일러로 가져옵니다.
- 끓는 용액에 유리 구슬을 넣고 5분 더 계속 끓입니다. 1분마다 용액을 부드럽게 휘젓습니다.
- 끓인 후 이 핫 비드 현탁액 ~5ml를 15ml 마이크로 원심분리기 튜브에 넣고 RT DI 워터를 채웁니다. 3,500 x g에서 5분 동안 원심분리기를 하고 상층액을 제거하고 버립니다.
- 핫 비드 현탁액 5ml를 더 옮기고 세척된 비드에 첨가하고 DI 워터를 더 채우고 잘 섞은 다음 다시 원심분리합니다. 약 50ml의 DI 워터를 사용할 때까지 이 절차를 반복하면 총 4-5회 세척합니다.
- 비드 현탁액을 1ml 바이알에 옮깁니다. 17,000 x g에서 5분 동안 원심분리하여 비드를 메탄올(재료 목록)로 3회 세척하는 것을 반복하고 마지막으로 100% 메탄올 1ml에 비드를 다시 현탁시킵니다.
- 비드 표면 Thiolation
- 50ml 원심분리 튜브에 메탄올 45.6ml, 아세트산 0.4ml(재료 목록), DI 물 1.85ml, 3-메르캅토프로필트리메톡시실란(MPTMS) 1.15ml(재료 목록) 및 2.1에서 준비된 비드 현탁액 1ml를 추가한 다음 RT에서 3시간 동안 배양합니다.
- 반응 후 모든 반응물을 신선한 메탄올로 한 번 세척하여 제거하고 비드를 500μl의 메탄올에 다시 현탁시킵니다. 이 농축된 유리 구슬 현탁액을 나사 뚜껑이 있는 20개의 건조하고 깨끗한 유리 바이알 세트로 골고루 나눕니다. 건조 아르곤 제트를 사용하여 메탄올을 증발시키고 바이알을 천천히 회전시켜 각 바이알의 측면에 얇은 건조 비드 층을 만듭니다.
- 구슬 바이알을 120°C로 예열된 건조 오븐에 5분 동안 넣은 다음 꺼내서 캡을 느슨하게 빠르게 놓습니다. 바닥에 건조제로 채워진 유리 진공 데시케이터에 바이알을 놓고 냉각될 때까지 진공 펌프로 데시케이터를 진공 청소기로 청소합니다.
- 진공 청소기로 청소한 데시케이터를 건조 아르곤으로 퍼지하여 데시케이터를 정상 대기압으로 만듭니다. 데시케이터 뚜껑을 제거하고 바이알의 캡을 빠르게 다시 조입니다. 바이알을 플라스틱 파라핀 필름으로 밀봉하고 건조하고 어두운 보관 상자에 RT로 보관하십시오.
- 즉시 사용 시, 건조 비드 1개 바이알을 복용하고 인산염 완충액(재료 목록)으로 한 번 세척하고 50μl의 인산염 완충액으로 다시 현탁하고 4°C에서 보관하십시오. 이 농축 비드 제제는 다음 단계에서 "MPTMS 비드"라고 합니다.
메모: 적절하게 보관하면 MPTMS 비드는 최대 3개월 동안 기능을 유지할 수 있습니다.
3. 비드 기능화
- 비드에 단백질을 공유 코팅합니다.
- 특정 부피의 단백질 스톡(예: 2.5μl)을 취하여 동일한 부피의 탄산염/중탄산염 완충액과 혼합하여 용액 1.
를 만듭니다.
메모: 부피는 스톡 농도와 비드 표면에 있는 단백질의 원하는 최종 부위 밀도에 따라 달라집니다.
- 작은 비커에 2-3mg의 MAL-PEG3500-NHS 링커(재료 목록)의 무게를 측정하고 탄산염/중탄산염 완충액으로 용해시켜 최종 농도 0.231mg/ml에 도달합니다.
- 용액 1을 3.1.2에서 제조된 동일한 부피의 링커 용액과 혼합합니다. 혼합물을 RT에서 30분 동안 배양하여 용액 2를 만듭니다.
- 한편, 바닥에 건조제를 채운 유리 진공 데시케이터에 캡이 헐거워진 링커 병을 놓고 5분 동안 진공 청소기로 청소한 후 데시케이터에 아르곤을 채웁니다. 뚜껑을 조이고 병을 꺼냅니다. 플라스틱 파라핀 필름으로 병을 밀봉하고 바닥에 건조제를 채운 용기에 넣고 -20 °C에서 보관하십시오.
메모: 3.1.2-3.1.4(3.1.3의 배양 제외)를 포함한 MAL-PEG3500-NHS 링커의 사용과 관련된 단계는 가능한 한 빨리 수행해야 합니다.
- 5μl의 MPTMS 비드를 용액 2와 혼합하고 인산염 완충액(재료 목록)을 추가하여 최종 부피를 250μl로 만듭니다.
- RT에서 밤새 비드를 배양하고 인산염 완충액으로 3회 세척한 후 100μl의 인산염 완충액에 다시 현탁하고 4°C에서 보관합니다.
- 단백질/스트렙타비딘(SA) 코팅 비드 준비
- 프로토콜 3.1.1-3.1.4를 따릅니다.
- 5μl의 MPTMS 비드를 용액 2 및 5μl의 4mg/ml Streptavidin-Maleimide(SA-MAL)(재료 목록) 용액과 혼합한 다음 인산염 완충액을 추가하여 최종 부피 250μl를 만듭니다.
- RT에서 밤새 비드를 배양하고 인산염 완충액으로 3회 세척한 후 마지막으로 100μl의 인산염 완충액에 다시 현탁하고 4°C에서 보관합니다.
- 유리 구슬에 Streptavidin 코팅
- 5μl의 MPTMS 비드와 5μl의 4mg/ml SA 용액을 혼합하고 140μl의 인산염 완충액을 추가합니다.
- RT에서 밤새 비드를 배양하고 인산염 완충액으로 3회 세척한 다음 50μl의 인산염 완충액에 다시 현탁하고 4°C에서 보관합니다.
- SA 코팅 비드를 Biotinylated 단백질로 코팅
- 5μl의 SA 코팅 비드를 단백질(원하는 코팅 밀도에 따라 부피)과 혼합하고 인산염 완충액을 추가하여 최종 부피를 100μl로 만듭니다.
- 혼합물을 4°C에서 하룻밤 동안 또는 RT에서 3시간 동안 배양하고 인산염 완충액으로 3회 세척한 다음 50μl 인산염 완충액에 다시 현탁하고 4°C에서 보관합니다.
4. 세포 준비
참고: 세포를 정제하려면 사용 중인 세포 유형에 해당하는 표준 세포 정제 프로토콜(예: T 세포 또는 특정 세포주)을 따르십시오.
- fBFP 실험의 경우, 세포 현탁액이 준비되면 DMSO에 용해된 Fura2-AM(재료 목록)을 세포 현탁액에 추가하여 최종 농도 2μM에 도달하고 RT에서 30분 동안 배양한 다음 한 번 세척합니다. 이 형광등이 장착된 세포 현탁액을 사용할 때까지 어두운 곳에 보관하십시오.
5. 마이크로피펫 및 세포 챔버 준비
- 마이크로피펫 준비
- 유리 절단기로 긴 모세관 유리관(재료 목록)을 약 3인치 길이의 짧은 조각으로 자릅니다. 마이크로피펫 풀러(재료 목록)에 한 조각을 장착하고 "당기기" 버튼을 클릭하여 모세관의 중간을 기계에 의해 가열하고 모세관이 양쪽 끝을 당겨 날카로운 끝이 있는 두 개의 모세관(원시 마이크로피펫)을 만듭니다.
메모: 제품 가이드라인에 따라 원료 피펫의 원하는 형태는 6-8mm 테이퍼와 0.1-0.5μm 팁을 갖습니다.
- 마이크로피펫 단조품의 피펫 홀더에 원시 피펫을 장착합니다(재료 목록). 가열하여 대장간의 유리 구를 녹입니다. 생 피펫의 끝을 유리 구 내부에 삽입합니다. 유리 구를 식히고 생 피펫을 당겨 외부에서 부수고 팁을 구 내부에 남겨 둡니다. 원하는 팁 오리피스를 얻을 때까지 이 절차를 반복합니다.
메모: 마이크로피펫 팁 내경의 예: 적혈구의 경우 2.0-2.4 μm, 비드의 경우 ~1.5 μm, T 세포의 경우 ~2-4 μm, 하이브리도마 세포의 경우 -7 μm.
- 세포실 구축
참고: 셀 챔버는 두 개의 금속 사각형(구리/알루미늄)과 이를 함께 연결하는 손잡이로 구성된 수제 챔버 홀더를 기반으로 구축되었습니다(그림 1D).
- 유리 절단기를 사용하여 40mm x 22mm x 0.2mm 커버슬립을 40mm x 11mm x 0.2mm 조각의 두 개(커버슬립 1 및 2)로 자릅니다. 두 개의 금속 사각형을 연결하는 방식으로 챔버 홀더의 윗면에 그리스로 커버슬립 1을 붙이고, 마찬가지로 커버슬립 2를 아래쪽에 붙여서 평행한 커버슬립 셀 챔버를 형성합니다(그림 1D).
- 피펫을 사용하여 두 커버슬립 사이에 200μl의 실험용 완충액을 주입합니다. 버퍼가 두 커버슬립에 모두 부착되었는지 확인합니다. 버퍼가 챔버의 양쪽 끝에 닿도록 챔버를 부드럽게 회전하고 흔듭니다.
- 실험용 완충 구역 옆에 있는 챔버의 양쪽에 미네랄 오일을 조심스럽게 주입하여 야외에서 완충액을 밀봉합니다. 프로브 비드(예: pMHC 코팅 비드), 적혈구 및 표적(예: T 세포)의 현탁액을 각각 완충 영역의 상부, 중부 및 하부 영역에 주입합니다.
4. BFP 실험
- 현미경(재료 목록)과 광원을 켭니다. 챔버를 메인 현미경 스테이지에 놓습니다(그림 1A, D).
- BFP의 세 마이크로피펫을 모두 설치합니다(그림 1D. 왼쪽: 프로브, 적혈구 잡기, 오른쪽: 표적, 세포 또는 비드 잡기, 오른쪽 아래: 도우미, 비드 잡기).
- 마이크로 주입기(재료 목록)를 사용하여 실험용 완충액으로 마이크로피펫을 다시 채웁니다. 피펫 홀더(재료 목록)를 제거하고 팁에서 물이 떨어지도록 낮은 곳에 두십시오. 마이크로피펫을 홀더 팁에 빠르게 삽입하고 삽입하는 동안 마이크로피펫에 기포가 들어가지 않도록 합니다. 홀더 나사를 조입니다.
- 각 피펫 홀더를 해당 마이크로 매니퓰레이터에 장착합니다. 마이크로피펫을 챔버 쪽으로 밀어 팁이 챔버 버퍼 영역으로 들어가도록 합니다. 마이크로피펫의 위치를 조정하고 현미경 시야에서 마이크로피펫을 찾습니다.
- 챔버 홀더 스테이지 주위를 이동하여 세 가지 요소(적혈구, 표적 및 프로브 비드)의 군체를 하나씩 찾습니다. 마이크로피펫의 끝이 하나의 세포/비드에 접근하도록 매니퓰레이터의 손잡이를 돌려 해당 마이크로피펫의 위치를 조정합니다. 해당 마이크로피펫 내부의 압력을 조정하여 세포/비드를 흡인합니다. 세 개의 마이크로피펫 모두 해당 요소를 캡처합니다.
- 챔버 홀더 스테이지 주위를 이동하여 실험이 수행될 주입된 요소의 콜로니에서 떨어진 열린 공간을 찾습니다. 현미경 시각적 모드를 전환하여 컴퓨터 프로그램의 이미지를 컴퓨터 화면에서 시각화합니다. 피펫 팁의 세 가지 요소를 모두 프로그램의 시야로 이동합니다.
- 프로브 비드와 RBC를 정렬하고 프로브 비드를 RBC의 정점까지 조심스럽게 움직인 다음 비드를 RBC에 잠시 충돌시킨 다음 부드럽게 후퇴시킵니다. 헬퍼 마이크로피펫의 압력을 조정하여 비드를 부드럽게 불어내어 RBC 정점에 접착된 상태로 유지되도록 합니다(그림 1F). 헬퍼 마이크로피펫을 치우고 타겟과 프로브 비드를 정렬합니다(그림 2A).
- 프로그램의 비전 필드 창에서 프로그램의 도구를 사용하여 프로브 마이크로 피펫 (Rp), RBC (R0), RBC와 프로브 비드 (Rc) 사이의 원형 접촉 면적의 각 반경을 측정하며, 이는 다음 방정식에 의해 RBC (k)의 스프링 상수를 추정 할 수 있으며, 여기서 Δp는 프로브 피펫 팁의 흡인 압력입니다. 참고: Hooke의 법칙에 따르면 결합력 F는 스프링 상수와 프로브 비드(d)의 변위의 곱, 즉 F = d에 의해 정량화될 수 있습니다(그림 2C).
- 원하는 RBC 스프링 상수를 프로그램에 입력합니다(프로토콜 섹션 4.6 참조). 스프링 상수는 일반적으로 힘 클램프 분석 및 접착 빈도 분석의 경우 0.25 또는 0.3pN/nm, 열 변동 분석의 경우 0.1pN/nm로 설정되며, 이는 필요한 흡인 압력을 1cm 단위의 물 단위로 반환합니다. 필요한 흡입 압력에 도달할 때까지 프로브의 피펫에 연결되는 물 탱크의 높이를 조정합니다.
- RBC 정점을 가로질러 수평선을 그리면 인접한 창에 이 선을 따라 각 픽셀의 밝기(회색조 값)를 나타내는 곡선이 생성됩니다. 임계값 선을 곡선 깊이의 약 절반이 되도록 드래그합니다(그림 2A, B).
메모: 임계값 라인 아래의 밝기 곡선의 최소 지점은 비드 경계의 위치를 나타내므로 하나의 로컬 최소값만 허용됩니다. 현재 두 개 이상의 로컬 최소값이 있는 경우 이미지가 최적이 아님을 나타냅니다(이미지의 초점이 맞지 않거나 프로브 비드와 RBC 간의 정렬 불량으로 인한 것일 수 있음).
- 원하는 실험 모드를 선택합니다: 열 변동 분석, 접착 빈도 분석 또는 힘 클램프 분석. 원하는 대로 매개변수를 설정합니다(예: 충돌력 = 15pN, 하중 속도 = 1,000pN/s, 접촉 시간 = 1초, 클램핑력 = 20pN(힘 클램프 분석의 경우) 등).
- "시작"을 클릭하면 프로그램이 타겟 파이펫을 이동하고 타겟을 프로브와 접촉 안팎으로 유도할 수 있습니다(자세한 내용은 대표 결과 섹션 참조). 데이터 수집은 프로브 비드의 위치를 실시간으로 기록하는 병렬로 수행됩니다. "실험 중지" 버튼을 클릭하여 프로그램을 중지하면 획득한 데이터를 저장할 수 있는 창이 나타납니다.
