경쟁 GTPase 결합 단백질 파트너를 연구하기 위한 경쟁 결합 분석

초록

출처: Williamson, R. C., et al. 경쟁 분석을 사용하여 GTPase 결합 단백질의 친화도 비교. J. Vis. 특급 (2015)

이 동영상은 GTPase 결합 단백질 파트너를 연구하기 위한 경쟁 분석을 보여줍니다. 마그네틱 비드에 고정된 뉴클레오티드 결합 GTPase 단백질을 활용하여 GTPase의 동일한 결합 부위에 대한 두 개의 상호 작용 단백질 파트너 간의 경쟁적 결합을 연구하여 단백질 파트너의 결합 친화성을 평가할 수 있습니다.

프로토콜

1. GST 태그가 지정된 GTPase의 정제

1. 500ml의 자가유도 배지(25 mM Na₂HPO₄, 25 mM KH₂PO₄, 50 mM NH₄Cl, 5 mM Na 2 SO₄, 2 mM MgSO₄, 2 mM MgSO₄, 2 mM CaCl₂, 37 °C에서 220 rpm으로 진탕)로 pGEX-Rac1 O/N으로 형질전환된 BL21과 같은 대장균 균주를 배양하고, 0.5% 글리세롤, 0.05% 포도당, 0.2% 유당, 5g 트립톤, 2.5g 효모 추출물, 100μg/ml 암피실린).
2. 10,000 x g, 4 °C에서 10분 동안 원심분리하여 박테리아를 수확합니다.
3. 20ml 단백질 추출 시약, 1x 프로테아제 억제제에 박테리아 펠렛을 재현탁하고 역전과 함께 RT에서 20분 동안 배양합니다.
4. 30분 동안 40,000 x g에서 원심분리하여 용해물을 정화합니다.
5. 인산염 완충 식염수(PBS: 10 mM Na₂HPO₄, 1.8 mM KH₂PO₄, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl)로 세척한 2 ml 글루타티온 마그네틱 비드를 추가합니다.
6. 2시간 동안 배양하고 4°C에서 반전으로 혼합합니다.
7. 단백질이 함유된 비드를 10ml PBS로 4회 세척하고, 자기 입자 분류기를 사용하여 각 단계에서 비드를 침전시킵니다.
8. 단백질이 로드된 비드를 2ml PBS에 재현탁하고 필요할 때까지 -80°C에서 100μl 분취액에 보관합니다.

2. GTPase 결합 단백질의 발현

1. 실험 전날, 각 GTPase 결합 단백질의 녹색 형광 단백질(GFP) 태그 버전을 인코딩하는 플라스미드를 다음과 같이 별도의 75cm² 플라스크에 HEK293T transfection. 뉴클레오티드 로딩 검증을 위해 GFP 태그가 지정된 TrioD1을 세 번째 75cm² 플라스크에 transfection HEK293T.
   1. 폴리에틸아민을 100μl 멸균 150mM NaCl에서 1mg/ml로 희석합니다.
   2. 223μl 환원 혈청 배지에 27μl의 희석된 폴리에틸렌아민을 첨가합니다.
   3. 12 μg 플라스미드 DNA를 250 μl 환원된 혈청 배지에 추가합니다.
   4. RT에서 각 튜브를 2분 동안 배양합니다.
   5. 폴리에틸아민과 DNA 혼합물을 단일 튜브에 결합하고 2분 동안 와류를 일으킵니다.
   6. RT에서 15-20분 동안 배양합니다.
   7. 90% 합류 HEK293T의 성장 배지(Dulbecco's Modified Eagle Media, 10% 소 태아 혈청, 2mM L-글루타민, 항생제 없음)를 5ml의 신선한 성장 배지로 교체합니다.
   8. 결합 된 polyethylamine / DNA 혼합물을 플라스크에 추가하고 37 ° C, 5 % CO₂에서 O / N을 배양합니다.

3. GTPase 결합 단백질의 정제

1. PBS에서 형질주입된 세포의 플라스크를 헹구고 플라스크를 5분 동안 배출하여 유리 액체를 흡입합니다.
2. 500μl 용해 완충액(50mM Tris-HCl(pH 7.8), 1% Nonidet P-40, 1x 프로테아제 억제제)의 세포를 마이크로분리 튜브로 긁어냅니다.
3. 4°C에서 30분 동안 반전으로 혼합하여 세포를 용해합니다.
4. 용해하는 동안, 40 μl GFP-트랩 비드 2개를 새로운 용해 완충액으로 3회 세척하고 2,700 x g에서 세척 사이에 2분 동안 비드를 침전합니다.
5. 21,000 x g에서 10분 동안 원심분리하여 용해물을 정화합니다.
6. 세척된 GFP 트랩 비드를 분리하기 위해 경쟁사 단백질의 각각의 명백하게 한 용해물을 옮기고 GFP-융합 단백질이 4 °C에서 반전으로 혼합하여 2시간 동안 결합할 수 있도록 합니다.얼음에 GFP-TrioD1 세포의 용해물을 보관하십시오.
7. 50 mM Tris-HCl (pH 7.8), 50 mM NaCl, 0.7 % (w / v) Nonidet P-40 및 50 mM Tris-HCl (pH 7.6), 20 mM MgCl₂, 세척 사이에 2 분 동안 2,700 x g에서 침전 비드에서 두 번로드 된 GFP-트랩 비드를 세척합니다.
8. 40 μl 0.2 M 글리신 (pH 2.5)을 추가하고 30 초 동안 위아래로 피펫팅하여 GFP-융합 단백질을 용리합니다. 즉시 21,000 x g에서 60 초 동안 비드를 침전하고 4 μl 1 M Tris-HCl (pH 10.4)을 포함하는 새로운 마이크로 분리 튜브로 액체를 옮깁니다. 정제된 단백질의 손상을 제한하기 위해 이 작업을 신속하게 수행하십시오.
9. 웨스턴 블롯으로 정제된 각 단백질 1μl를 분석하고 항-GFP 항체로 프로브하여 제조업체의 프로토콜에 따른 정량적 블로팅 시스템을 사용하여 상대적 수율을 설정합니다. 또는 비신초닌산(BCA) 분석으로 단백질 농도를 측정하지만 단백질이 동일한 방식으로 분석과 반응하지 않거나 오염 단백질이 있는 경우 오류가 발생합니다.
10. 50 mM Tris-HCl (pH 7.6) 및 20 mM MgCl₂ 를 첨가하여 몰 단백질 농도를 균등화합니다.

4. GTPase의 뉴클레오티드 로딩

1. 1단계에서 준비한 GST-Rac1 마그네틱 비드 분취액 1개를 해동합니다.
2. GST-Rac90 비드 90 μl를 취하고 20 mM Tris-HCl (pH 7.6), 25 mM NaCl, 0.1 mM DTT 및 4 mM EDTA로 3 회 세척하여 자기 입자 분류기를 사용하여 각 단계에서 비드를 침전시킵니다.
3. 비드에서 완충액을 흡입하고 100μl 20mM Tris-HCl(pH 7.6), 25mM NaCl, 0.1mM DTT 및 4mM EDTA를 추가합니다.
4. 경쟁 실험에 GDP, GTP 또는 뉴클레오티드 로딩이 필요하지 않은지 여부에 따라 60μl GST-Rac1 비드에 12μl 100mM GDP, 12μl 10mM 구아노신 5'-[γ-thio]triphosphate(GTPγS) 또는 뉴클레오타이드를 추가하지 않습니다.
5. 뉴클레오티드 로딩 대조군의 경우, 나머지 beads를 3개의 10μl 분취량으로 분할하고 각 튜브에 2 μl 100 mM GDP, 2 μl 10 mM GTPγS 또는 뉴클레오타이드를 추가하지 않습니다.
6. 교반과 함께 30°C에서 30분 동안 비드 믹스를 배양합니다.
7. 실험 혼합물에 1 M MgCl₂ : 3 μl를 첨가하여 뉴클레오티드 결합 Rac1을 안정화하고(단계 4.4), 각 대조군 혼합물에 0.5 μl를 첨가합니다(단계 4.5).

5. 경쟁 바인딩

1. 각각 다음을 포함하는 6개의 마이크로< 튜브를 설정합니다> 200 μl 50 mM 트리스-HCl (pH 7.6), 20 mM MgCl₂
   10μl 실험용 뉴클레오티드 로딩 Rac1 비드(4.7단계부터)
   5 μl Rac1 결합 단백질 A (일정 결합 단백질)
2. 각 튜브에 0, 1, 2.5, 5, 10 또는 20 μl Rac1 결합 단백질 B(가변 결합 단백질)를 추가합니다. 이러한 부피는 불변 및 가변 결합 단백질의 스톡 농도가 거의 동일하다고 가정하며 조정이 필요할 수 있습니다.
   1. 두 단백질의 결합 친화도에 큰 차이가 있는 경우 결합 단백질 A와 B의 부피를 조정하고 이는 실험 반복을 통해 경험적으로 결정해야 합니다. 50 mM Tris-HCl (pH 7.6) 및 20 mM MgCl₂ 를 첨가하여 결합 혼합물의 총 부피를 235 μl로 구성한다.
다음을
3. 포함하는 마이크로방< 튜브를 설정합니다.> 200 μl 50 mM 트리스-HCl (pH 7.6), 20 mM MgCl₂
   10μl 실험용 뉴클레오티드 로딩 Rac1 비드(4.7단계부터)
   10 μl Rac1 결합 단백질 A (일정 결합 단백질)
4. GDP, GTPγS 및 뉴클레오티드 조절 튜브 없음:
   200 μl 50 mM 트리스-HCl (pH 7.6), 20 mM MgCl₂
   10μl control Rac1 비드는 GDP, GTPγS 또는 뉴클레오티드 없이 4.5단계에서 로드되고 4.7.
   단계에서 안정화되었습니다. 180 μl HEK293T GFP-TrioD1 용해물, 3.6
   단계에서와 같이 준비 4 μl 1 M MgCl₂
5. 혼합물을 2 시간 동안 배양하고 4 ° C에서 반전으로 혼합합니다.
6. 50mM Tris-HCl(pH 7.6) 및 20mM MgCl₂로 비드를 세 번 세척합니다.
7. 20 μl 환원 샘플 버퍼 (50 mM Tris-HCl (pH 7), 5 % SDS, 20 % 글리세롤, 0.02 mg / ml 브로 모페놀 블루, 5 % β-메르 캅토 에탄올)에서 결합 단백질을 용출합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
버그버스터	노바젠	70584-3 (영문
COMPLETE 프로테아제 억제제	로슈	전화 05 056 489 001
글루타티온 마그네틱 비드	뚫다	88821
폴리에틸렌이민, 분지, 평균 Mw ~ 25,000	시그마 알드리치	408727-100ML
오피멩	생명 기술	31985-047
Dulbecco의 변형 독수리 미디어	시그마 알드리치	D5796
소 태아 세럼	생명 기술	10270-1-6
L-글루타민	생명 기술	제25030-024
GFP-Trap_A	크로모텍	GTA-20
국내 총생산	시그마 알드리치	G7127 (영문	매우 불안정합니다. 부분 표본 및 재구성 즉시 -80으로 저장
지티피γS	시그마 알드리치	G8634 (영어	매우 불안정합니다. 부분 표본 및 재구성 즉시 -80으로 저장
블로킹 버퍼	시그마 알드리치	나6429
트윈-20	시그마 알드리치	P9416
Anti-GFP 항체	리빙 컬러스	632592	1/1000 희석으로 사용
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