바이러스 항원에 대한 혈청 내 항체 동형을 검출하기 위한 바이러스 항원 마이크로어레이 분석

초록

출처: Khan, S., et al., 바이러스 아형에 걸쳐 혈청 항체의 폭을 측정하기 위해 인플루엔자 항원 마이크로어레이 사용. J. Vis. 특급 (2019)

이 비디오에서는 인플루엔자 바이러스 균주의 항원 아형이 인쇄된 마이크로어레이 슬라이드를 사용하여 여러 인간 혈청 샘플에서 항체 동형을 검출하는 프로세스를 보여줍니다.

프로토콜

1. 인플루엔자 항원 마이크로어레이 생산

1. 마이크로어레이 슬라이드에 항원 인쇄
   1. 동결건조된 각 항원을 0.001% Tween-20(T-PBS)을 사용하여 인산염 완충 식염수(PBS)에서 0.1mg/mL의 농도로 재구성합니다. 각 재구성된 항원 10μL를 처리되지 않은 384웰 평면 바닥 플레이트의 개별 웰로 전달합니다.
   2. 항원을 시료 채널로 흡인하고 직접 접촉 및 모세관 작용을 통해 16패드 니트로셀룰로오스 코팅 유리 슬라이드에 증착하는 저용량 마이크로어레이 스포팅 핀이 있는 마이크로어레이 프린터를 사용하여 항원을 인쇄합니다.
      1. 소스 플레이트 구성 및 인쇄 매개변수로 인쇄 소프트웨어(예: Gridder)를 프로그래밍합니다.
         1. 풀다운 메뉴를 사용하여 이 인쇄 방법에 사용할 플레이트 유형의 이름을 선택합니다. 이 연구에서는 처리되지 않은 384웰 평평한 바닥 플레이트를 사용합니다.
         2. Number of Plates 옆에 있는 텍스트 상자를 선택하고 이 인쇄 프로토콜에 사용할 샘플 플레이트의 수를 입력합니다. 이 연구에서는 1개의 플레이트를 사용합니다.
         3. 이 메서드에 사용할 핀 구성을 선택합니다. 이 스터디에서는 8핀 구성을 사용합니다.
         4. 원점 오프셋이 슬라이드 원점(관리 섹션에서 보정됨)과 인쇄 핀이 슬라이드에서 인쇄를 시작하는 위치 사이의 거리(X 및 Y 방향)인지 확인합니다.
         5. Array Design 탭을 사용하여 배열의 크기와 모양(점 간격 및 하위 배열당 점 수)을 정의합니다. 이 연구에서는 8개의 핀을 사용하여 18x18 형식의 16패드 슬라이드에 324개의 스폿(직경 180μm, 간격 300μm)을 인쇄합니다.
         6. 인쇄 핀이 샘플을 집어 넣는 방법에 대한 매개변수를 선택합니다. 이 연구를 위해 각 핀은 250nL의 항원 용액을 흡인하고 40개 지점 각각에 1nL를 인쇄합니다(8개 핀 모두에 대해 총 20개의 슬라이드).
         7. 핀 청소 프로토콜과 블로팅 프로토콜을 구성합니다. 이 연구를 위해 각 핀 인쇄 항원은 초음파 세척 용기의 멸균 ddH₂O에 담근 후 다음 항원을 흡인합니다.
         8. 샘플 블록이 슬라이드에 인쇄되는 순서를 정의합니다. 어레이 소프트웨어는 각 마이크로어레이 내의 항원 배열을 설명하기 위해 주석이 달린 그리드 인덱스(.gal) 파일을 구성합니다.
            메모: 맨 윗줄은 이미징 중에 그리드의 방향을 지정하기 위해 기준점(이미징에 사용되는 모든 파장의 형광 포함, 예: 이 연구에서 Qdot 585nm 스트렙타비딘 접합체 및 Qdot 800nm 스트렙타비딘 접합체의 혼합)에 사용됩니다. 장시간 인쇄 실행의 경우, 피펫팅을 위아래로 한 다음 원심분리하여 소스 플레이트의 항원을 주기적으로 다시 부유시키거나 새로운 소스 플레이트를 준비하고 사용할 수 있습니다.
   3. 프로브되지 않은 마이크로어레이 슬라이드를 차광 상자에 넣고 장기 보관을 위해 실온의 데시케이터 캐비닛에 보관하십시오.
      메모: 이 시점에서 프로토콜이 무기한 일시 중지될 수 있습니다.
2. 품질 관리 검사 수행(폴리히스티딘 태그 필요)
   1. 슬라이드를 프로빙 챔버에 부착하고 2.1.1-2.1.2 단계에 설명된 대로 그림 1에 표시된 대로 차단 버퍼로 재수화합니다.
   2. 마우스 단클론 폴리-His 항체를 1:100으로 여과된 1x 차단 buffer.
      에 희석합니다. 메모: 정제되지 않은 단백질 항원(예: in vitro transcription and translation system에서 발현)을 사용하여 마이크로어레이를 직접 인쇄하는 경우, 단백질 발현 시스템의 구성 요소(예: E. coli lysate)를 혈청 희석에 사용되는 차단 버퍼와 1:10 비율로 추가하여 이러한 구성 요소에 대한 항체를 차단합니다.
   3. 흡인 후 어레이 패드를 포함하는 각 슬라이드 챔버에 100μL의 희석된 poly-His 항체를 추가하고 셰이커에서 실온에서 2시간 또는 4°C에서 밤새 배양합니다. 2.2.1단계에서 설명한 대로 T-TBS 버퍼로 3번 세척합니다. 비오틴 접합 염소 항-마우스 IgG 2차 항체 1:200을 차단 완충액에 희석하고, 흡인 후 웰당 100μL를 첨가한 후 셰이커에서 실온에서 1시간 동안 배양합니다. T-TBS 버퍼로 3회 세척합니다.
   4. Qdot 585nm 스트렙타비딘 콘주게이트를 블로킹 버퍼에서 4nM로 희석하고, 흡인 후 웰당 100μL를 첨가한 다음, 셰이커에서 실온에서 1시간 동안 배양합니다. T-TBS 버퍼로 3번 세척한 다음 TBS 버퍼로 한 번 세척합니다(Tween 제외).
   5. 2.2.5 – 3.1.2.
      단계에 설명된 대로 슬라이드를 분해하고 정량화합니다. 메모: 이 품질 관리 프로토콜을 사용하려면 단백질 항원에 His10 태그가 포함되어야 합니다. 또는 다른 태그가 포함된 경우 해당 태그에 대한 항체 또는 리간드를 사용하여 품질 관리 검사를 수행할 수 있습니다.

2. 마이크로어레이를 이용한 인플루엔자 항체 프로브 혈청

1. 항체 결합을 위해 마이크로어레이에서 혈청을 배양합니다.
   1. 클립을 사용하여 마이크로어레이 슬라이드를 챔버에 부착하고 그림 2.
      와 같이 프레임에 배치합니다. 메모: 항상 손과 기구로 마이크로어레이 패드를 만지지 마십시오. 슬라이드가 패드 면이 위를 향하고 오른쪽 상단 모서리에 있는 작은 노치가 향하도록 합니다.
   2. 마이크로어레이 슬라이드를 여과된 1x 블로킹 버퍼의 웰당 100μL로 재수화하고 100μL의 블로킹 버퍼에 혈청을 1:100으로 희석합니다(처리되지 않은 96웰 플레이트 또는 2mL 튜브 사용 가능). 재수화된 마이크로어레이 슬라이드를 커버된 프레임과 희석된 혈청에 각각 30분 동안 실온에서 100-250rpm의 오비탈 쉐이커로 별도로 배양합니다. shaker.
      에서 모든 후속 배양 단계를 유사하게 수행합니다. 메모: 혈청은 동결-해동 주기를 최소화하기 위해 장기 보관을 위해 -80°C에서 분주하고 동결해야 하며, 사용하기 전에 미립자를 제거하기 위해 소용돌이를 혼합하고 원심분리해야 합니다. 이 단계 중과 후에 슬라이드 챔버를 주의 깊게 관찰하여 슬라이드 챔버를 재조립해야 하는 누출을 감지하십시오.
   3. 2차 수집 플라스크가 있는 진공 라인에 연결된 피펫 팁을 사용하여 패드를 건드리지 않고 각 챔버의 모서리에서 차단 버퍼를 조심스럽게 흡입합니다. 이후의 모든 흡인 단계를 유사하게 수행합니다. 패드가 건조되지 않도록 흡인 후 신속하게 희석된 혈청을 패드에 첨가하십시오.
   4. 젖은 종이 타월로 둘러싸인 보조 용기 안의 트레이에 덮인 프레임을 놓고 증발을 방지하기 위해 밀봉합니다. 4 °C에서 로킹 쉐이커로 하룻밤 동안 배양합니다(또는 100-250 rpm의 오비탈 쉐이커에서 실온에서 2시간 동안 배양 가능).
2. Quantum-dot-conjugated 2차 항체를 사용한 라벨 결합 혈청 항체
   1. 상기한 바와 같이 챔버에서 혈청을 조심스럽게 흡인하고, T-TBS 완충액 웰당 100μL를 첨가하고(pH 7.5로 조정된_ddH2O에서 20mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 0.05% Tween-20, 시판적으로 얻을 수 있음), 100-250rpm의 오비탈 쉐이커에서 5분 동안 배양합니다. 이 세척 단계를 총 3회 반복합니다(모든 후속 세척 단계는 유사하게 수행됨).
   2. 차단 완충액에서 1μM로 희석된 2차 항체 혼합물을 준비하고 균질성을 유지하기 위해 사용 전과 사용 중에 피펫팅으로 철저히 혼합합니다.
      메모: 분석 재현성을 유지하려면 실험 간 데이터의 정량적 비교가 계획된 모든 프로빙 실험에 대해 각 2차 항체의 동일한 배치를 사용해야 합니다. 2차 항체의 특정 농도는 친화도에 따라 달라질 수 있습니다. 가능하면 제조업체의 프로토콜을 따릅니다.
   3. 최종 세척 후 챔버에서 완충액을 흡입하고, 2차 항체 혼합물 웰당 100μL를 첨가하고, 셰이커에서 실온에서 2시간 동안 배양합니다.
   4. 2차 항체 혼합물을 T-TBS 완충액으로 3회 세척한 다음 TBS 완충액(Tween 제외)으로 한 번 세척합니다.
   5. 챔버에서 마이크로어레이 슬라이드를 조심스럽게 분리하여 패드를 건드리지 않도록 하고, 여과된 ddH₂O로 부드럽게 헹구고, 50mL 튜브에 넣고 500 x g에서 10분 동안 원심분리하여 건조시킵니다.
   6. 프로빙된 마이크로어레이 슬라이드를 차광 상자에 넣고 장기 보관을 위해 실온의 데시케이터 캐비닛에 보관하십시오.
      메모: 이 시점에서 프로토콜은 최대 1주일 동안 일시 중지될 수 있습니다.

3. 마이크로어레이 내 항원에 대한 항체 결합을 정량화합니다.

1. 마이크로어레이 슬라이드를 시각화하고 스폿 형광 강도를 정량화하여 항체 결합을 측정합니다.
   1. 소프트웨어가 내장된 휴대용 이미저를 사용하여 마이크로어레이 슬라이드의 이미지를 획득합니다.
      1. Configure Imager 탭에서 적절한 슬라이드 구성을 선택합니다. 이 연구에서는 16패드 슬라이드를 사용합니다.
      2. Image Control(이미지 제어) 탭에서 적절한 형광 채널을 선택하고 혈청의 반응성에 따라 gain, exposure time 및 acquisition time을 조정하여 최적의 이미지를 얻을 수 있습니다. 본 연구에서 IgA와 IgG의 형광 채널은 각각 585nm와 800nm였으며, 이미징 설정은 50의 게인, 500ms의 노출 시간, 1초의 획득 시간이었다.
      3. 캡처를 클릭하여 이미지 획득 프로세스를 시작합니다.
         메모: 마이크로어레이 슬라이드는 어둡고 건조하게 보관되는 한 신호의 저하 없이 여러 설정에서 다시 이미지화할 수 있습니다. 슬라이드와 호환되는 경우 다른 이미징 시스템을 사용할 수 있습니다.
2. 기준 마커를 기반으로 방향이 지정된 그리드를 사용하여 어레이 스폿을 감지하고 스폿 강도를 픽셀 강도의 중앙값에서 스폿 주변에서 측정된 배경을 뺀 값으로 측정합니다. 1.1.2단계에서 생성된 .gal 파일을 활용하여 각 마이크로어레이의 개별 항원에 스폿 강도를 연결하는 내장 이미저 소프트웨어를 사용하여 이 정량화 알고리즘을 일괄적으로 수행합니다.
   1. 파일 정보 패널에서 컴퓨터의 해당 폴더를 선택하여 .gal 파일을 업로드하고 분석 옵션 섹션에서 분석 출력 파일을 저장할 폴더를 지정합니다.
   2. 이미지 컨트롤(Image Control) 탭에서 수량화할 획득된 이미지 중 하나를 열고 오른쪽 상단 모서리에 있는 자동(Auto) 버튼을 선택합니다.
   3. 오른쪽 하단 모서리에 있는 Array Analysis 섹션에서 소프트웨어의 지시에 따라 기준 템플릿을 만듭니다.
   4. Batch Analysis(배치 분석)를 클릭하고, 정량화할 이미지가 포함된 폴더를 선택하고, 이전 단계에서 만든 기준 템플릿을 선택합니다. 소프트웨어는 각 이미지를 분석하고 스폿 강도를 정량화합니다.
      메모: 이 단계는 스프레드시트 조작 또는 분석 소프트웨어에서 이후에 조작할 수 있는 마이크로어레이의 각 개별 항원에 결합하는 각 혈청 표본 내의 항체를 정량화하는 스폿 강도를 포함하는 .csv 파일을 생성합니다.
3. 원시 데이터를 분석하여 항원과 혈청 검체 간의 항체 결합을 비교합니다. 이 연구를 위해 585nm 및 800nm 형광 스폿 강도로 측정된 IgA 및 IgG 항체를 서로 다른 날짜에 다른 슬라이드를 사용하여 실험의 2회 독립 실행 사이에 모든 항원에서 비교하고 분석 재현성을 측정하기 위해 상관 관계 분석을 수행했습니다.
   메모: 발현 혼합물로 인쇄된 정제되지 않은 단백질의 경우, 데이터 분석은 DNA 대조군이 없는 백그라운드 빼기부터 시작해야 합니다.

결과

그림 1: 인플루엔자 항원 마이크로어레이 인쇄 및 프로빙 프로토콜의 개략도. 왼쪽에서 오른쪽으로 마이크로어레이는 니트로셀룰로오스 코팅된 슬라이드에 인쇄되며, 이 슬라이드는 양자 점 접합 2차 항체를 사용하여 혈청에서 IgG 및 IgA 항체를 조사하는 데 사용되며, 휴대용 이미저를 사용하여 이미지화된 슬라이드와 히트 맵을 생성하기 위해 분석된 결과

와 함께 인쇄됩니다.

그림 2: 프로빙 챔버를 마이크로어레이 슬라이드에 부...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
16패드 니트로셀룰로오스 코팅 유리 슬라이드	그레이스 바이오 랩스	305016
1x GVS FAST 차단 버퍼	Fischer Scientific	10485356
ArrayCam 휴대용 이미저	그레이스 바이오 랩스	다른 이미징 장치는 마이크로어레이 스폿의 해상도와 양자점의 여기 및 방출 파장을 달성할 수 있는 경우 슬라이드를 시각화하는 데 사용할 수 있습니다.
Biotin-conjugated goat anti-mouse-IgG 항체	써모 피셔
HiBase 384웰 플레이트	Greiner 바이오 원	T-3037-11
마이크로어레이 핀	ArrayIt	GMP2	서로 다른 각 마이크로어레이 프린터에는 고유한 맞춤형 마이크로어레이 핀이 필요할 수 있습니다.
Mouse monoclonal poly-His 항체	시그마-알드리치	H1029
OmniGrid 100 마이크로어레이 프린터	GeneMachines		이 작업에 사용된 마이크로어레이 프린터의 버전은 더 이상 상업적으로 이용할 수 없지만, 업데이트된 유사한 장비는 Digilab(Hopkinton, MA)의 OmniGrid Accent 마이크로어레이 프린터이며, 동일한 프로토콜은 대부분의 상업적으로 이용 가능한 마이크로어레이 프린터로 수행할 수 있습니다.
ProPlate 슬라이드 챔버	그레이스 바이오 랩스
ProPlate 슬라이드 클립	그레이스 바이오 랩스	204838
ProPlate 슬라이드 프레임	그레이스 바이오 랩스	246879
Quantum dot 585 nm conjugated goat anti-human-IgA 항체	그레이스 바이오 랩스
양자 점 585nm 스트렙타비딘 접합체	써모 피셔	Q10111MP
Quantum dot 800 nm conjugated goat anti-human-IgG 항체	그레이스 바이오 랩스