방법 논문

액틴과 미세소관 결합 역학을 시각화하기 위한 TIRF 현미경 검사

2025년 7월 8일

이 논문에서

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

출처: Henty-Ridilla, J.L., TIRF(Total Internal Reflection Fluorescence) 현미경에 의한 체외 액틴 및 미세소관 결합 역학 시각화. J. Vis. 특급 (2022년)

이 동영상은 액틴 및 미세소관 중합 역학을 시각화하기 위한 전반사 현미경 기반 기술인 TIRF에 대해 설명합니다. 이 방법을 사용하면 액틴과 미세소관 결합 역학의 고해상도 이미징을 실시간으로 수행할 수 있으며, 이는 세포 누화를 이해하는 데 필수적입니다.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 커버 슬립 세척

참고: Smith et al., 2013에 따른 워시(24mm x 60mm, #1.5) 커버슬립.

  1. 플라스틱 슬라이드 우편물 용기에 커버슬립을 정리하십시오.
  2. 커버슬립을 다음 용액에 순차적으로 담그고 30-60분 동안 초음파 처리하여 각 용액 사이에 ddH2O로 10회 헹굽니다: 주방 세제 한 방울로 ddH2O, 0.1 M KOH. 커버슬립은 100% 에탄올에 담아 최대 6개월 동안 보관할 수 있습니다.
    메모: 장갑을 낀 손가락으로 유리 표면을 만지지 마십시오. 대신 집게를 사용하십시오.

2. mPEG 및 비오틴-PEG-실란으로 코팅 세척(24mm x 60mm, #1.5) 커버슬립

참고: 이 프로토콜은 특이적으로 비오틴-스트렙타비딘 시스템을 사용하여 TIRF 이미징 평면 내에서 액틴과 미세소관을 배치합니다. 다른 코팅 및 시스템(예: 항체, 폴리-L-라이신, NEM 미오신 등)이 사용될 수 있습니다.

  1. PEG-실란 및 비오틴-PEG-실란 분말의 분취액을 해동합니다.
  2. PEG 분말을 80% 에탄올(pH 2.0)에 용해시켜 사용 직전에 10mg/mL mPEG-실란 및 2-4mg/mL 비오틴-PEG-실란의 코팅 원액을 생성합니다.
    메모: PEG 분말은 종종 용해된 것처럼 보이지만 미세한 수준은 아닐 수 있습니다. 적절한 재부유는 지속적인 피펫팅으로 ~1-2분이 소요됩니다. 사용자는 분말 용해가 나타난 후 추가로 10회 피펫팅하는 것이 좋습니다.
    주의: 80% 에탄올(pH 2.0)을 만들 때 농축된 HCl로부터 피부를 보호하기 위해 장갑을 착용하십시오.
  3. 집게를 사용하여 에탄올 저장소에서 깨끗한(24mm x 60mm, #1.5) 커버슬립을 제거합니다. 질소 가스로 건조시키고 깨끗한 페트리 접시에 보관하십시오.
  4. 100μL의 코팅 용액으로 커버 슬립 코팅: 80% 에탄올(pH 2.0)에서 2mg/mL mPEG-실란(MW 2,000) 및 0.04mg/mL 비오틴-PEG-실란(MW 3,400)의 혼합물.
    메모: 스파스 코팅(권장)의 경우 2mg/mL mPEG-실란과 0.04mg/mL 비오틴-PEG-실란을 사용합니다. 고밀도 코팅의 경우 2mg/mL mPEG-실란, 4mg/mL 비오틴-PEG-실란을 사용하십시오.
  5. 커버슬립을 70°C에서 최소 18시간 동안 또는 사용할 때까지 배양합니다.
    메모: 코팅된 커버슬립은 70°C에서 2주 이상 보관하면 성능이 저하됩니다.

3. 이미징 플로우 챔버 조립

  1. 양면 양면 테이프 스트립 12개를 24mm 길이로 자릅니다. 테이프 뒷면의 한쪽 면을 제거하고 깨끗한 이미징 챔버에 있는 6개의 홈에 인접한 테이프 조각을 고정합니다.
    메모: 테이프는 적절한 조립을 위해 평평해야 하며, 그렇지 않으면 이미징 챔버가 누출됩니다. 부딪히지 않도록 테이프 뒷면을 조심스럽게 제거합니다. 테이프 챔버 접촉을 매끄럽게 하기 위해 깨끗한 표면에 테이프 챔버를 밀어 넣는 것이 좋습니다.
  2. 두 번째 테이프 뒷면 조각을 제거하여 각 챔버 홈을 따라 테이프의 끈적한 면이 노출되도록 합니다. 챔버 테이프 면이 위로 향하게 하여 깨끗한 표면에 놓습니다.
  3. 에폭시 수지와 경화제 용액을 1:1(또는 제조업체의 지침에 따라)로 작은 계량 보트에 혼합합니다.
  4. P1000 팁을 사용하여 각 이미징 챔버 홈의 끝에 있는 테이프 스트립 사이에 혼합 에폭시 한 방울을 떨어뜨립니다(빨간색 화살표; 그림 1A). 챔버 테이프/에폭시 면이 위로 향하게 하여 깨끗한 표면에 놓습니다.
  5. 70°C 인큐베이터에서 코팅된 커버슬립을 제거합니다. 커버슬립의 코팅된 표면과 코팅되지 않은 표면을 ddH2O로 6회 헹구고 여과된 질소 가스로 건조시킨 다음 커버슬립 코팅면이 테이프를 향하도록 하여 이미징 챔버에 부착합니다.
  6. P200 또는 P1000 피펫 팁을 사용하여 테이프-유리 인터페이스에 압력을 가하여 테이프와 커버슬립이 잘 밀봉되도록 합니다.
    메모: 적절하게 밀봉하면 양면 테이프가 반투명해집니다. 테이프 챔버 접점이 충분하지 않은 이미징 챔버는 누출됩니다.
  7. 조립된 챔버를 실온에서 최소 5-10분 동안 배양하여 사용하기 전에 에폭시가 챔버 웰을 완전히 밀봉할 수 있도록 합니다. 관류 챔버는 조립 후 12-18시간 이내에 만료됩니다.
    메모: 테이프 배치와 사용된 양면 테이프의 두께에 따라 조립된 챔버의 최종 부피는 20-50μL입니다.

4. 관류 챔버의 컨디셔닝

  1. 관류 펌프(속도 500μL/min으로 설정)를 사용하여 다음과 같이 관류 챔버에서 컨디셔닝 용액을 순차적으로 교환합니다.
    1. 50 μL의 1% BSA를 사용하여 이미징 챔버를 프라이밍합니다. Luer-lock 피팅 저장소에서 초과 버퍼를 제거합니다.
    2. 유량 50μL의 0.005mg/mL 스트렙타비딘. 실온에서 1-2분 동안 배양합니다. 저장소에서 초과 버퍼를 제거합니다.
    3. 50 μL의 1% BSA를 유동화하여 비특이적 결합을 차단합니다. 10-30초 동안 배양합니다. 저장소에서 초과 버퍼를 제거합니다.
    4. 유량 50μL의 따뜻한(37°C) 1x TIRF 버퍼(1x BRB80, 50mM KCl, 10mM DTT, 40mM 포도당, 0.25%(v/v) 메틸셀룰로오스(4,000cp)).
      메모: 저장소에서 초과 버퍼를 제거하지 마십시오. 이렇게 하면 챔버가 건조되어 시스템에 기포가 유입될 수 있습니다.
    5. 옵션: 1x TIRF buffer.
      에 희석된 안정화된 50μL 및 50% 비오틴화된 미세소관 시드 유동 메모: 적절한 희석은 경험적으로 결정되어야 하며 배치 간 변동성을 포함해야 합니다. 시야당 10-30개의 씨앗을 생성하는 희석액은 이 설정에서 잘 작동합니다.

5. 현미경 준비

참고: 동적 액틴 필라멘트와 미세소관을 포함하는 생화학 반응은 120-150mW 고체 레이저, 온도 보정 63x 오일 이멀젼 TIRF 대물렌즈 및 EMCCD 카메라가 장착된 반전된 TIRF(Total Internal Reflection Fluorescence) 현미경을 사용하여 시각화/수행됩니다. 이 예제의 단백질은 488nm(미세소관) 및 647nm(액틴) 파장에서 시각화됩니다.

  1. 무대 설정tage/대물 히터 장치는 첫 번째 생화학 반응을 이미징하기 최소 30분 전에 35-37°C를 유지합니다.
  2. 이미지 획득 매개변수를 다음과 같이 설정합니다.
    1. 획득 간격을 15-20분 동안 5초 간격으로 설정합니다.
    2. 488 및 647 레이저 노출을 5%-10% 전력에서 50-100ms로 설정합니다. 현미경에 적합한 TIRF 각도를 설정합니다.
      메모: 현미경 설정에 관계없이 레이저 출력, 노출 및 TIRF 각도를 설정하는 가장 간단한 방법은 폴리머만 있는 이미지를 조정하는 것입니다(아래 5.2.2.1 및 5.2.2.2 참조). 사용자는 여전히 감지를 허용하는 가장 낮은 레이저 출력 및 노출 설정을 사용하는 것이 좋습니다.
      1. 중합 반응(그림 1C)을 조정하여 액틴 필라멘트 조립을 시작하고 647nm에서 이미지를 획득합니다. 적절하게 조정합니다.
      2. 두 번째 조절된 관류 웰에서 중합 반응을 조정하여 미세소관 어셈블리(그림 1C)를 시작하고 488nm에서 시각화합니다. 적절하게 조정합니다.

6. 단백질 반응 혼합물 준비

  1. 형광 표지된 튜불린의 원액을 준비합니다.
    1. 다음과 같이 Abs280에서 분광 광도법을 통해 집에서 만든 표지되지 않은 튜불린의 농도를 측정합니다.
      1. GTP가 없는 1xBRB80의 빈 분광 광도계.
      2. 결정된 흡광 계수 115,000 M-1 cm-1과 다음 공식을 사용하여 튜불린의 농도를 계산합니다.
        figure-protocol-1
    2. GTP가 결핍된 1x BRB80 20μL로 상업적으로 제조된 동결건조 라이신 표지 488-튜불린을 10μM(1mg/mL, 100% 라벨)로 재현탁합니다.
    3. 100μM의 비표지 재활용 튜불린의 7.2μL 분취액을 얼음에서 해동합니다.
      메모: 재활용된 튜불린은 냉동 단백질 스톡에서 형성된 중합 불능 이량체를 제거하기 때문에 시험관 내에서 성공적인 미세소관 조립에 매우 중요합니다.
    4. 3 μL의 10 μM 488-튜불린을 100 μM 비표지 튜불린의 7.2 μL 분취량과 결합하며, 사용 15분 이내에 합니다.
  2. 형광 표지된 액틴의 원액을 준비합니다.
    1. 집에서 만든 단백질의 경우, 다음과 같이 분광 광도법 AbsAbs290 및 Abs650을 통해 액틴의 농도 및 퍼센트 라벨을 결정합니다.
      1. G-버퍼가 있는 빈 분광 광도계.
      2. 결정된 흡광 계수 25,974 M-1 cm‐1과 다음 공식을 사용하여 표지되지 않은 액틴의 농도를 계산합니다.
        figure-protocol-2
      3. 라벨링되지 않은 액틴의 흡광 계수, 0.03의 형광 보정 계수 및 다음 공식을 사용하여 Alexa-647-actin으로 표시된 라이신의 농도를 계산합니다.
        figure-protocol-3
      4. 다음과 같이 Alexa-647에 대해 결정된 ε 239,000M-1cm-1을 사용하여 Alexa-647-actin의 백분율 레이블을 계산합니다.
        figure-protocol-4
    2. 3μM 100% 라벨링된 비오틴 액틴(라이신 잔기에 라벨링됨)의 2μL 분취액 1개를 해동합니다. 18μL의 G-버퍼를 첨가하여 10배 희석합니다.
    3. 3 μL의 희석된 비오틴화 액틴과 표지되지 않은 및 표지된 액틴(위)을 적절한 부피로 결합하여 최종 혼합물이 12.5 μM의 총 액틴과 10%-30% 형광 표지가 되도록 합니다.
      메모: 30% 이상의 형광 액틴 단량체(최종)는 필라멘트를 배경에서 식별하기 어렵게 만들어 이미징 해상도를 손상시킬 수 있습니다.
  3. 반응 혼합물을 준비합니다(그림 1C).
    1. 이미징 15분 전에 12.5μM 액틴 혼합물 원료(6.2.3) 2μL를 튜불린 원료 혼합물(6.1.4)과 결합하여 세포골격 혼합물(튜브 A)을 준비합니다. 사용할 때까지 얼음에 보관하십시오.
    2. 2x TIRF 완충액, 표백제 방지, 뉴클레오티드, 완충액 및 보조 단백질을 포함한 다른 모든 실험 성분 및 단백질을 결합하여 단백질 반응 혼합물(튜브 B)을 준비합니다. 그림 1C.
      에 예제가 나와 있습니다. 메모: 최종 희석은 추정된 생리학적 범위 내에서 ATP, GTP 및 이온 강도를 포함하는 1x TIRF 버퍼를 생성합니다.
  4. 튜브 A와 튜브 B를 37 ° C에서 30-60 초 동안 별도로 배양합니다. 반응을 시작하려면 튜브 B의 내용물을 혼합하여 튜브 A에 첨가하십시오(아래).

>7. 이미지 액틴 및 미세소관 역학

  1. 관류를 잘 조절합니다(그림 1B, 위의 4단계).
  2. 튜브 B(반응 혼합물)의 내용물을 튜브 A(세포골격 혼합물)에 첨가하여 액틴과 미세소관 조립을 동시에 시작합니다(그림 1C).
  3. 15μM 유리 튜불린, 1mM GTP 및 0.5μM 액틴 단량체가 보충된 1x TIRF 완충액과 적절한 부피의 완충액 대조군을 포함하는 반응의 50μL를 유동화합니다.
  4. 현미경 소프트웨어를 사용하여 15-20분 동안 5초마다 타임랩스 동영상을 기록합니다.
    메모: 액틴과 미세소관 역학의 시작은 2-5분 이내에 발생합니다(그림 2). 지연이 길어지면 온도 제어에 문제가 있거나 반응 혼합물 내 단백질의 농도 관련 문제가 있음을 나타냅니다.
  5. 새로운 관류 웰을 컨디셔닝하고(4단계) 완충액 부피를 관심 조절 단백질(즉, Tau) 및 완충액 대조군(그림 1C)으로 교체합니다. 7단계(위)에 설명된 대로 획득하여 emergent actin-microtubule 기능에 대한 조절 단백질을 평가합니다.

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결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
그림 1. 실험적 회로도: 이미지 획득을 위한 플로우 챔버 조립. (A) 이미징 챔버 어셈블리. 위에서 아래로: IBIDI 이미징 챔버는 관류 웰(화살표로 표시)을 따라 테이프로 고정됩니다. 테이프 뒷면의 두 번째(흰색) 층(사용자에게 더 나은 방향을 제시하기 위해 표시된 이미지에서 왼쪽)을 제거하고 관류 챔버(화살표)의 가장자리에 에폭시를 도포합니다. 참고: 사용자가 에폭시를 배치할 위치를 보다 쉽게 지정할 수 있도록 이 이미지에서는 흰색 뒷면이 켜져 있습니다. 세척 및 코팅된 커버슬립은 코팅면이 관류 웰 내부를 향하도록 하여 이미징 챔버에 부착됩니다. (B) 비오틴-스트렙타비딘 결합을 위한 이미징 챔버의 컨디셔닝 단계를 보여주는 순서도. (C) 동적 미세소관 및 액틴 필라멘트의 TI...

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공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
선언된 이해 상충이 없습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1% BSA (w/v)피셔 사이언티픽BP1600-100이를 위해(TIRF 챔버 차단) BSA는 ddH20에 재현탁되고 0.22μm 필터를 통해 여과됩니다.
1× BRB80만든80mM 파이프, 1mM MgCl2, 1mM EGTA, pH 6.8(KOH 포함
80mM 파이프, 1mM MgCl2, 1mM EGTA, pH 6.8(KOH 포함Sigma Aldrich Inc, 미주리주 세인트루이스G2133-50구카탈라아제, 분취량과 결합하여 사용할 때까지 -80 oC에서 보관하십시오
100 μM 튜불린Cytoskeleton Inc, 콜로라도주 덴버T240집에서 만든 튜불린은 중합 무능 튜불린을 제거하기 위해 사용하기 전에 재활용해야 합니다(Hyman et al. (1992)29; Li and Moore (2020)30 ). 시중에서 판매되는 튜불린은 너무 희석되어 재활용할 수 없는 경우가 많지만 제조업체의 지침에 따라 재현탁하고 초원심분리(278,000 × g)를 통해 사용 전 60분 동안 사전 세척하면 잘 작동합니다.
100mM ATPGold Biotechnology Inc, 올리벳, 미주리가-08ddH20(pH 7.5)에 재현탁하고 필터를 멸균합니다.
100 밀리엠 GTP피셔 사이언티픽AC2262500101× BRB80(pH 6.8)에 재현탁하고 필터를 멸균했습니다.
120-150mW 고체 레이저라이카 마이크로시스템즈11889151; 11889148
2 mg/mL 카탈라아제Sigma Aldrich Inc, 미주리주 세인트루이스C40-100포도당 산화효소와 결합, 분취 및 사용할 때까지 -80 oC에서 보관
2× TIRF 버퍼호메드2× BRB80, 100mM KCl, 20mM DTT, 80mM 포도당, 0.5%(v/v) 메틸셀룰로오스(4,000cp); 참고: 반복되는 동결-해동 주기를 피하기 위해 TIRF 반응에 0.1M GTP 1μL 및 0.1M ATP 1μL를 별도로 추가했습니다.
24 × 60mm, #1.5 커버 글라스Fisher Scientific, 매사추세츠주 월섬제22-266882커버글라스는 사용하기 전에 광범위하게 세척해야 합니다(Smith et al. (2014)22
37 oC 히트 블록
37 oC 수조
5mg/mL 스트렙타비딘(600x 재고)Avantor, 필라델피아, 펜실베니아RLS000-01Tris-HCl(pH 8.8)에 재현탁; 사용 당일 분취액을 HEK 완충액에서 1×로 희석
5 분 에폭시 수지 및 경화제록타이트, 록키 힐, 코네티컷1365736결합된 수지와 경화제는 경화하는 데 최대 30분이 소요될 수 있습니다.
50% 비오틴화-GpCpp 미세소관 씨앗세포골격 Inc; 만든T333P(선택 사항) GppCpp 또는 Taxol 안정화 미세소관 씨앗은 미세소관 중합을 보다 효율적으로 매개할 수 있습니다. 탁솔(Taxol)과 GppCpp는 미세소관 격자 구조와 미세소관의 안정화된 부분에 결합하는 특정 조절 단백질의 능력에 영향을 줄 수 있는 다양한 방식으로 미세소관을 안정화합니다. 다양한 종류의 미세소관 씨앗을 만드는 방법은 Hyman et al. (1992)에 요약되어 있습니다.
70 C 인큐베이터
액틴 믹스 스톡집에서 만든; 이 프로토콜최대 6개의 반응을 위해 표지된(형광 및 비오틴화된) 및 표지되지 않은 액틴으로 구성된 12.5μM 액틴 혼합물.최종 TIRF 반응에는 2μL의 원액이 사용됩니다. 각 반응에 사용된 액틴의 최종 농도는 0.5μM(10% Alexa-647, 0.09% 비오틴 표지)입니다.
적절한 버퍼 컨트롤만든평가 중인 모든 단백질의 완충액 조합
비오틴-PEG-실란(MW 3,400)레이산바이오(주)비오틴-PEG-SIL-34002-5 mg 분취액에 분배하고, 질소로 다시 채우고, 파라필름으로 밀봉하고, 사용할 때까지 건조제와 함께 -20 °C에서 보관
비오틴화 액틴세포골격 Inc; 만든AB07비오틴 액틴은 라이신 잔기에 표지하여 만들어지므로 최소 100% 표지된 것으로 간주되지만 로트/제제에 따라 다릅니다. 최적의 비오틴화 액틴 농도는 특정 용도/실험 설계에 대해 경험적으로 결정되어야 합니다. 농도가 높을수록 더 효율적인 추적이 가능하지만 중합 또는 조절 단백질과의 상호 작용을 방해할 수 있습니다. 여기서, 소량(0.09% 또는 900 pM)의 비오틴화된 액틴이 최종 TIRF 반응에 존재합니다.
주방 세제Dawn, Procter and Gamble, 오하이오주 신시내티알 수 없는 이유로 블루 버전은 사용 가능한 다른 색상보다 커버슬립을 더 효율적으로 청소합니다.
드라이아이스
형광 표지된 액틴세포골격 Inc; 만든아칸소05집에서 만든 형광 표지 된 액틴은 -20 °C에서 50 % 글리세롤이 보충 된 G- 버퍼에 저장됩니다 (Spudich et al. (1971) 47; Liu 외. (2022)48 ). 형광 표지된 액틴은 G-버퍼에 대해 투석되고 사용 전 278,000 ×g에서 60분 동안 초원심분리를 통해 사전 세정됩니다.
형광 표지된 튜불린세포골격 IncTL488M, TLA590M, TL670M20 μL 1× BRB80(10 μM 최종 농도)에 재현탁하고 초원심분리(278,000 × g)를 통해 사용 전 60분 동안 사전 세척합니다.
G-버퍼만든3mM 트리스-HCl(pH 8.0), 0.2mM CaCl2, 0.5mM DTT, 0.2mM ATP
HEK 버퍼만든20mM HEPES(pH 7.5), 1mM EDTA(pH 8.0), 50mM KCl
얼음
얼음 양동이
이미징 챔버IBIDI, 위스콘신주 핏츠버그80666다양한 커버슬립 코팅을 활용하기 위해 바닥이 없는 챔버 주문
iXon Life 897 EMCCD 카메라Andor, 벨파스트, 북아일랜드8114137
LASX 프리미엄 현미경 소프트웨어라이카 마이크로시스템즈8114137
메틸셀룰로오스 (4,000 cp)시그마 알드리치 IncM0512
TIRF 모듈이 장착된 현미경 베이스Leica Microsystems, 독일 베츨라11889146
mPEG-실란 (MW 2,000)
) ) . 호 ). (영문) 합니다. 시리즈

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