살아있는 세포에서 수용체-리간드 상호작용을 시각화하기 위한 Lattice Light Sheet 현미경 검사

초록

출처: Rosenberg, J., et al. 격자 광시트 현미경을 사용하여 표면 T 세포 수용체 역학 4차원 시각화. J. Vis. 특급 (2020).

이 비디오에서는 살아있는 T 세포와 항원 제시 세포 간의 상호 작용을 시각화하기 위한 격자 광시트 현미경 기술에 대해 설명합니다. 이 방법은 초박형 격자 광시트를 상호 작용하는 세포 쌍에 집중시켜 일련의 2차원 이미지를 얻고, 이를 결합하여 세포-세포 상호 작용의 시공간 역학을 나타내는 고해상도 4차원 이미지를 얻는 것을 포함합니다.

프로토콜

1. LLSM 데일리 얼라인먼트 수행

참고: (중요) 이 정렬 프로토콜은 사용된 LLSM 기기를 기반으로 합니다(재료 표 참조). 각 LLSM은 다를 수 있으며 특히 집에서 구축한 경우 서로 다른 정렬 전략이 필요할 수 있습니다. 적절한 일상 정렬을 수행하고 섹션 2를 계속합니다.

1. 물 10mL와 플루오레세인 30μL(1mg/mL 스톡)를 LLSM 수조(~10mL 용량)에 추가하고 이미지(홈)를 눌러 대물렌즈를 이미지 위치로 이동하고 단일 베셀 레이저 빔 패턴을 확인합니다. 가이드와 사전 설정된 관심 영역(ROI)을 사용하여 레이저 빔을 정렬하여 빔을 모든 방향에서 균형을 이루는 얇은 패턴으로 만듭니다.
   1. 빔은 파인더 카메라에서도 초점이 맞춰진 것처럼 보여야 합니다. 두 개의 미러 틸트 조절기, 상단 마이크로미터, 초점 및 방출 대물렌즈 칼라를 사용하여 조정합니다. 올바르게 정렬된 빔에 대해서는 그림 1 A 및 B를 참조하십시오.
2. 플루오레세인을 완전히 제거하려면 최소 200mL의 물로 수조와 대물렌즈를 세척하십시오.
3. 이미징 미디어(imaging media)의 물리적 포인트 스프레드 함수(PSF)에 대한 이미징 미디어(poly-L-lysine이 포함된 5mm 커버슬립에 비드를 부착하여 준비, 재료 표 참조, 사전 준비 및 재사용 가능)의 이미지 표준 형광 비드.
   참고: 나중에 처리하기 위해 하나의 구슬만 볼 수 있으므로 뷰어에 단독으로 있거나 단일 구슬을 얻기 위해 쉽게 자를 수 있는 구슬을 찾으십시오.
   1. 'X Galvo 범위' 상자에서 3으로 설정하여 디더링을 켭니다. Live를 눌러 현재 필드를 봅니다. Z 방향을 따라 이동하여 커버슬립과 비드를 찾습니다. Z를 따라 이동하여 비드의 중심을 찾고 Stop을 눌러 레이저를 일시 중지합니다. 3D를 선택하고 Center를 누른 다음 Execute를 누릅니다. 그러면 데이터가 수집됩니다.
   2. 틸트 미러, 대물렌즈 칼라 및 초점 마이크로미터를 가장 높은 회색 값으로 수동으로 조정한 다음 필요에 따라 조정하여 대물 스캔, z 갈보, z+대물렌즈(totPSF) 및 샘플 스캔(samplePSF) 캡처 모드에 대한 적절한 패턴을 얻습니다. 적절하게 조정된 최대 강도 투영(MIP)에 대해서는 그림 1 C-F를 참조하십시오.
      메모: 다양한 캡처 모드(objective scan, z galvo, z+objective 및 sample scan)는 광시트가 샘플을 통해 이동하는 방식을 변경합니다. 정렬에는 모든 스캔 모드를 사용해야 합니다.
   3. 샘플 스캔은 실험 중에 데이터가 수집되는 방법을 보여줍니다. deskewing 및 deconvolution을 위해 sample scan mode에서 Execute를 눌러 샘플 PSF를 수집합니다. 레이저를 세 가지 색상 모드(488, 560, 647)로 변경하고 실행을 다시 누릅니다.
      메모: LLSM 이미지는 비스듬히(57.2°) 있기 때문에 "샘플 스캔" 모드에서 캡처한 이미지는 이 각도에서 수집되므로 "비뚤어집니다". 비스듬히 보정은 이 각도를 보정하고 이미지를 실제 z 스택으로 "재정렬"하는 프로세스입니다. 이러한 데이터는 이미징 매체와 실험 중에 이미징될 모든 채널에서 수집되어야 합니다. 이것이 제대로 수집되지 않으면 데이터가 제대로 왜곡되지 않습니다. 마찬가지로 매체가 37°C(또는 원하는 실험 온도)로 가열되었는지 확인합니다.

2. LLSM으로 셀 설정하기

1. 100,000개의 APC(항원제시세포)(50μL)를 5mm 직경의 원형 커버슬립에 넣고 10분 동안 안정화시킵니다.
2. 샘플 홀더에 그리스를 바르고 커버 슬립 셀이 위로 향하게 추가하십시오. 수조에 넣기 전에 거품이 생기지 않도록 커버슬립 뒷면에 이미징 미디어 한 방울을 떨어뜨립니다. 샘플 홀더를 피에조에 나사로 고정하고 Image (Home)를 누릅니다.
3. LLSM 및 이미징 소프트웨어(재료 표 참조)가 제대로 작동하는지 확인하기 위해 이미지화할 APC를 찾습니다.
   메모: 디더링을 3으로 설정하고 두 가지 색상에 대해 60 z 단계 및 10 ms 노출로 0.4 μm 단계 크기로 이미지를 생성하면 ~200 nm XY 및 400 nm Z 해상도의 3D 이미지의 프레임당 1.54초가 됩니다. 이러한 설정은 세포 크기, 원하는 z 해상도 및 사용된 형광 표지 기술의 신호 강도에 따라 조정해야 할 수 있습니다. 레이저 출력 사용량은 사용된 형광 라벨링 기술에 따라 달라집니다.
   1. Live를 눌러 현재 이미지를 봅니다. Z를 따라 이동하여 커버슬립과 셀을 찾습니다.
   2. Z 방향으로 이동하여 APC의 중심을 찾은 다음 Stop을 눌러 레이저를 일시 중지합니다. 3D를 확인하고 원하는 설정을 입력하고 Center를 누른 다음 Execute를 누릅니다. 그러면 데이터가 수집됩니다.
4. 스테이지를 load 위치로 낮추고 이미징 배지(100,000개 세포)의 T 세포 50μL를 커버슬립 바로 위에 적가합니다. 피펫 팁 끝에 물방울이 형성되도록 한 다음 팁을 수조 액체에 대는 것이 가장 좋습니다. "Image (Return)"를 클릭하여 스테이지를 뒤로 올립니다.
5. 이미징을 시작합니다. 원하는 스택 크기와 타임랩스 길이를 설정해야 합니다. 예를 들어, 0.4μm 스텝 크기에서 60개의 z 스택을 생성하고 500개의 시간 프레임을 입력합니다. (일반적으로) 광표백을 방지하기 위해 500프레임에 도달하기 전에 녹화를 중지합니다. 라이브 모드를 사용하여 셀 쌍을 검색하고, 준비가 되고 원하는 설정이 입력되면 실행을 눌러 데이터를 수집합니다. 예를 들어 그림 2를 참조하십시오.

결과

그림 1: LLSM 정렬.(A) LLSM 이미징 실험을 위한 원하는 빔 패턴. (B) 빔 정렬 프로세스의 스크린샷; 왼쪽에는 좁아지고 초점이 맞춰진 빔을 보여주는 초점 창이 있습니다. 오른쪽 상단에는 빔이 창 내 중앙에 있음을 보여주는 그래프가 있습니다. 오른쪽 하단에는 파인더 카메라가 있으며, 이 카메라 역시 얇고 초점이 맞춰진 빔이어야 합니다. (C) 대물렌즈 스캔에 의한 비드의 최대 강도 투영(MIP). (D) z-galvo 스캔에 의한 비드의 최대 강도 투영(MIP). (E) z+대물 스캔에 의한 비드의 최대 강도 투영(MIP). (F) 샘플 스캔에 의한 비드의...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
5mm 원형 커버 슬립	세계적인 정밀 기기	502040	이미징용
Alexa Fluor 488 anti-mouse TCR β chain 항체	바이오레전드	109215	이미징용
플루오레세인 나트륨 염	시그마-알드리치	F6377	현미경 정렬용
FluoSpheres 카르복실레이트 변형 마이크로스피어	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	F8810	현미경 정렬용
이마리스	비트플레인	해당 사항 없음	추적 소프트웨어; 추적 소프트웨어를 위한 다른 옵션으로는 Amira 또는 Trackmate(피지)가 있습니다.
Lattice Light-Sheet 현미경	3i	해당 사항 없음	사용 현미경
Leibovitz의 L-15 미디엄, 페놀 레드 없음	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	21083027	이미징용
슬라이드북	3i	해당 사항 없음	LLSM 이미징 소프트웨어
폴리-L-라이신	Phoenix Research 제품	P8920-100ML	이미징용