세포막에서 나노막대의 확산 역학을 시각화하기 위한 암시야 현미경 검사

초록

출처: Ge, F., et al. 단일 나노 입자 암시야 현미경을 사용하여 세포막에서 금 나노막대의 확산 역학 시각화. J. Vis. 특급 (2021).

이 비디오에서는 특정 관심 세포주의 세포막과 플라즈몬 금 나노막대의 상호 작용을 모니터링하기 위해 단일 입자 추적(SPT) 분석과 결합된 암시야 현미경(DFM) 기술에 대해 설명합니다. 결합된 DFM 및 SPT 분석을 통해 높은 시공간 해상도로 세포막을 통한 나노막대 움직임을 시각화할 수 있습니다.

프로토콜

1. 현미경 슬라이드 준비

참고: 활성이 높은 3세대에서 10세대의 U87 MG 세포가 SPT 실험에 사용됩니다.

1. 피라냐 용액으로 이미 세척한 22mm × 22mm 커버슬립을 에탄올(99.9%)에 담그어 살균합니다.
2. 집게를 사용하여 에탄올 용액에서 커버 슬립을 꺼내고(1.1단계) 화염에 에탄올을 태워 살균합니다. 모든 에탄올이 연소되면 커버 슬립을 2mL의 세포 배지(페놀 레드 없음)로 채워진 플라스틱 세포 배양 접시(35 x 10mm)에 넣습니다.
3. 커버슬립에 세포 현탁액 50μL를 추가하고 접시를 앞뒤, 왼쪽, 오른쪽으로 부드럽게 밀어 세포를 고르게 분포시킵니다. 가습한 분위기에 두십시오.
4. 커버슬립의 U87 MG 세포가 20%–40% 포화도(~12시간)에 도달하면 20μL의 CTAB-AuNR(보호제로 세틸트리메틸암모늄 암모늄 브로마이드 분자로 합성된 금 나노로드, 138pM)을 접시에 넣고 분산시킵니다. 가습된 분위기에서 5분 동안 배양합니다.
5. 1.4단계에서 접시의 배양 배지 100μL(페놀 레드 없음)를 피라냐 용액으로 사전 세척된 홈이 있는 유리 슬라이드(그림 1)의 홈에 추가합니다.
6. 접시에서 커버슬립을 꺼내 현미경 유리 슬라이드의 홈 위쪽에 뒤집어 놓습니다(그림 1). 매니큐어로 밀봉하고 말리고 무대에 올려 SPT 실험을 실시합니다.

2. 암시야 현미경으로 단일 입자 추적 실험 수행(그림 1).

1. 기름에 잠긴 암시야 콘덴서(개구수(NA) 1.43-1.20)에 오일 한 방울을 놓고 손잡이를 돌려 콘덴서가 유리 슬라이드에 닿도록 합니다.
2. 커버 유리 상단에 오일 한 방울을 떨어뜨리고 초점 손잡이를 돌려 60x 오일 이멀젼 대물렌즈(NA 0.7–1.25)가 오일에 닿도록 합니다.
3. 광원을 켜고 초점 노브를 약간 돌려 이미징 평면의 초점을 맞춥니다.
   메모: 시야에서 배경은 검은색이고 세포는 밝으며 CTAB-AuNR(종횡비~2:1, 그림 2)은 작은 색상(빨간색, 노란색 또는 녹색) 산란 반점입니다.
4. 컬러 CMOS 카메라로 산란광을 샘플링합니다. 소프트웨어에서 "카메라 아이콘"을 클릭하여 TIFF 형식을 기록하고 내보내 이미지를 저장합니다.

3. 데이터 수집

1. 단일 장기 궤적 추출
   1. 그림 3에 설명된 대로 작동하여 시계열 암시야 이미지를 "RGB color" 모드에서 "8비트" 모드로 변환합니다. 이미지 J에서 이미지 | 유형 | 8 비트. 대비를 조정하려면 이미지 | 조정 | 밝기 | 대비.
   2. 대상 입자를 선택하고 "Ctrl+X"를 사용하여 배경을 boxing하고 삭제하여 시계열 배경을 잘라냅니다.
   3. "Plugins | 파티클 트래커 클래식 | 파티클 트래커".
   4. 반경을 6으로, 컷오프를 0으로, 백분위수를 0.01%.
      로 설정합니다. 메모: 입자를 감지하려면 Preview의 도움으로 위의 세 가지 매개변수를 조정하십시오. 반경이 대상 입자보다 약간 크고 가장 작은 입자 간 분리보다 작은지 확인합니다. 백분위수는 후보 입자가 될 강도 분포의 하한입니다.
   5. 링크 범위를 5로 설정하고 변위를 10.
      로 설정합니다. 메모: 연속적인 인접 프레임 사이에 입자를 연결하려면 위의 두 매개변수를 조정합니다. 디스플레이스먼트(Displacement)는 파티클이 연속적인 두 프레임 사이에서 이동할 수 있는 최대 픽셀이고, 링크 범위(Link Range)는 최상의 해당 일치를 결정할 때 고려해야 할 연속 프레임의 수입니다.
   6. "확인"을 클릭하여 ParticleTracker 결과 창을 열고 결과를 확인합니다.
   7. "Visualize All Trajectories(모든 궤적 시각화)"를 클릭하여 생성된 궤적을 검사합니다.
   8. 소프트웨어 생성 궤적이 AuNR의 이동 궤적과 일치하지 않는 경우 상단의 "Relink Particles" 메뉴를 클릭하여 감지된 입자를 다른 링크 범위 및 백분위수 매개변수로 다시 연결합니다.
   9. 소프트웨어에서 생성된 궤적과 AuNR의 이동 궤적이 일치하는 경우 결과를 저장하려면 "전체 보고서 저장"을 클릭하십시오.
      참고: 이미지 J를 사용하여 단일 장기 궤적을 추출하는 예가 그림 4에 나와 있습니다.

결과

그림 1: 암시야 현미경의 광학 경로, 현미경 슬라이드 준비 및 AuNR의 극성각(θ)을 계산하기 위한 이중 채널 차이 방법의 개략도. 이미지의 눈금 막대는 2μm입니다.

그림 2: CTAB-AuNR의 특성화. (A) CTAB@AuNRs의 TEM 이미지. (B) CTAB@AuNRs의 LSPR 스펙트럼. (C) 단일 입자 강도의 분포 : 유리에 CTAB@AuNRs (왼쪽 패널), 원형질막에 CTAB@AuNRs (오른쪽 패널).

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
CTAB 코팅 금 나노로드(CTAB-AuNR)	나노시즈	NR-40-650	85 nm*40 nm
컬러 CMOS 카메라	올림푸스	DP74	일본
커버슬립	시토글라스	z10212222C	22*22 밀리미터
암시야 현미경 검사	니콘	80나는	정립 현미경
소 태아 혈청(FBS)	지브코	10099141
피지	미국 국립보건원(National Institutes of Health)	2.0.0-RC-69/1.52 피	ImageJ의 분포
그루브 유리 슬라이드	돛 브랜드	7103	단일 오목
이미지 J	이미지 J	1.52 J
MATLAB을	매스웍스	R2019b
MATLAB 코드			https://github.com/fenggeqd/ 조브-2020
플라스틱 세포 배양 접시	송골매	353002
플라스틱 세포 배양 접시	송골매	353001	35*10 밀리미터
U87 MG 세포	아메리칸 타입 컬처 컬렉션	ATCC HTB-14	인간 원발성 교모세포종 세포주
최소 필수 매체(MEM)	지브코	51200038	페놀 레드 없음
페니실린-스트렙토마이신	지브코	15140122