$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. 현미경 개조 및 대물 렌즈
- 적절한 필터 큐브를 사용하여 형광 현미경의 필터 휠에 50/50 미러를 삽입합니다(그림 1). 50/50 거울은 반사 방지 코팅이 되어 있으므로 주의해서 다루십시오.
메모: 우리는 현미경의 빈 필터 큐브에 50/50 거울을 사용했습니다. 50/50 미러는 다이크로익 미러가 있는 곳에 삽입됩니다.
- 고배율/높은 개구수(NA) 오일 대물렌즈를 사용합니다.
메모: 이 프로토콜에서는 100x/1.3 NA 대물렌즈를 사용했습니다.
2. 미세소관을 표면에 부착하기 위한 챔버 준비
- 깨끗한 현미경 슬라이드와 22mm x 22mm 커버슬립(정립 현미경용) 또는 22mm x 22mm 및 18mm x 18mm 커버슬립(도립 현미경용). 필요에 따라 지표면을 수정합니다. 예를 들어ample, 알칼리성 세제(재료 표 참조)를 사용하여 커버슬립을 청소한 다음 그 사이와 그 후에 증류수로 100% 에탄올을 세척합니다.
- 면도날과 다른 현미경 슬라이드를 가장자리로 사용하여 3mm 너비의 플라스틱 파라핀 필름 스트립(재료 표 참조)을 자릅니다.
- 깨끗한 22 x 22mm 커버 슬립에 3mm 간격으로 두 개의 플라스틱 파라핀 필름 스트립을 놓습니다. 그런 다음 18mm x 18mm 커버슬립을 배치하여 채널을 형성합니다. 정립 현미경을 사용하는 경우 깨끗한 현미경 슬라이드 위에 스트립을 놓고 그 위에 커버슬립을 놓습니다.
- 파라핀 필름이 밀봉된 채널을 형성할 수 있도록 100°C에서 10-30초 동안 열 블록에 커버슬립(또는 슬라이드)을 놓습니다.
- 피펫을 사용한 관류에 의한 50 μg/mL의 항체(in Brinkley Buffer 1980 (BRB80))를 유동화합니다. 10분 동안 배양합니다.
메모: 당사는 항 로다민 항체를 사용하여 로다민 표지된 미세소관 씨앗을 표면에 결합합니다. 또는 avidin을 사용하여 비오틴 표지된 미세소관 씨앗 또는 비오틴화된 금 입자에 결합할 수 있습니다. 용액에 튜불린이 없는 상태에서 미세소관을 간단히 관찰하기 위해(즉, 비동적 분석법) 항튜불린 항체를 사용할 수 있습니다.
- BRB80 버퍼로 5회 세척합니다. 0.22μm 필터를 사용하여 용액을 필터링하는 것이 좋습니다.
- BRB80에 1% 폴록사머 407(삼중 블록 공중합체)을 유동시켜 비특이적 결합에 대해 표면을 차단합니다. 10분 동안 배양합니다.
- BRB80 버퍼로 5회 세척합니다.
- 샘플을 현미경에 놓을 준비가 되었습니다. 샘플이 건조되는 것을 방지하려면 채널 끝에 BRB80 완충액 두 방울을 추가하고 필요할 때 보충합니다.
3. 현미경 정렬
- 현미경 스테이지에 샘플을 놓습니다. 에피 조명 광원을 켭니다.
- 샘플 표면에 초점을 맞춥니다. 광학 경로 내의 광학 장치에서 나오는 빛의 후방 반사로 인해 대물렌즈가 위아래로 움직일 때 여러 표면을 관찰하게 됩니다. 샘플 표면을 찾는 좋은 방법은 파라핀 필름 가장자리에 초점을 맞추는 것입니다. 표면이 발견되면 시야를 챔버의 중심으로 설정합니다.
- 필드 다이어프램을 필드의 중앙에 놓습니다. 정렬되면 다이어프램을 다시 엽니다.
메모: 나사 조정은 산발적으로, 아마도 3-6개월마다 또는 문제를 해결할 때만 수행해야 합니다.
- Bertrand 렌즈를 밀어 view 대물렌즈의 출구 동공(후면 초점면).
- 대물렌즈의 출구 동공 가장자리 너머로 조리개 조리개(AD)를 닫습니다.
- 조정 나사를 사용하여 AD를 출구 동공의 중앙에 놓습니다. AD를 열고 가장자리를 출구 pupil의 가장자리와 일치시켜 다시 확인합니다.
메모: 이 조정은 산발적으로만 수행해야 합니다.
- 조리개 조리개를 대물렌즈 NA의 약 2/3로 설정합니다.
4. 안정화된 미세소관 또는 40nm 금 입자 이미징
참고: 안정화된 미세소관과 금 나노입자는 우수한 대조군 샘플로 사용됩니다. IRM 성능을 평가하고 최적의 조리개 조리개 개방을 설정하는 데 도움이 되는 첫 번째 단계로 표면 부착 미세소관 또는 금 나노입자를 이미지화하는 것이 좋습니다(섹션 7).
- 카메라의 노출 시간을 10ms로 설정하고 카메라 다이나믹 레인지의 채도에 가깝게 조명을 조정합니다.
- BRB80(또는 40nm 금 입자)의 10μL의 guanylyl-(alpha, beta)-methylene-diphosphonate(GMPCCP) 또는 taxol-stabilized microtubules에서 피펫을 사용하여 새로운 샘플에 관류하고 표면 이미징을 통해 결합을 모니터링합니다. 시야 내에 10-20개의 미세소관이 결합되면 BRB80.
로 샘플을 2x 세척합니다.
메모: 잘 정렬된 현미경을 사용하면 배경 빼기 없이 미세소관을 볼 수 있어야 합니다.
10초 - 동안 1초 지연 기간의 타임랩스를 설정하여 10개의 이미지를 획득합니다(10ms 노출에서).
- 배경 이미지를 가져옵니다. 이렇게 하려면 스테이지 컨트롤러 또는 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 채널 장축을 따라 스테이지를 이동하면서 지연 없이 100개의 이미지를 획득합니다(즉, 100fps @ 10ms 노출에 가까운 스트리밍).
메모: 배경은 100개 이미지의 중앙값입니다. 중앙값을 취하면 조명 프로파일 및 광학 장치의 먼지와 같은 기타 고정 기능은 보존되고 다른 모든 것은 필터링됩니다. 샘플에 기울어짐이 없어야 하는데, 이는 스테이지가 이동함에 따라 축 위치가 변경되고 궁극적으로 배경 이미지의 품질을 저하시키므로 발생합니다. 기울기를 피할 수 없는 경우 다른 방법은 시드를 흐르게 하기 전에 평균화된 배경 이미지를 획득하는 것입니다.
- 이미지를 처리하고 분석하려면 6단계로 이동합니다.
5. 이미징 미세소관 역학
- 브레인 튜불린을 사용한 미세소관 역학의 경우 샘플 히터 온도를 37°C로 설정합니다.
- 피펫을 사용하여 새로운 샘플에 관류하여 BRB80에서 10μL의 GMPCCP 안정화 미세소관 시드를 유동화하고 표면을 실시간으로 이미징하여 표면에 결합하는 것을 모니터링합니다(즉, 스트리밍 중). 10-20개의 씨앗이 시야각과 결합되면 BRB80으로 2x 채널 부피를 사용하여 샘플을 세척합니다(BRB80은 37°C 또는 최소한 실온에서 예열해야 함).
메모: 잘 정렬된 현미경을 사용하면 배경 빼기 없이 씨앗을 볼 수 있어야 합니다.
- 중합 혼합물(BRB80 완충액에서 7.5μM 비표지 튜불린 + 1mM 구아노신 삼인산(GTP) + 1mM 디티오트레이톨(DTT))의 흐름. 미세소관 성장을 측정하기 위해 획득 소프트웨어를 사용하여 15분 동안 5초(초당 0.2프레임(fps))마다 이미지를 획득하도록 타임랩스를 설정합니다.
- 대비를 향상시키려면 각 시점에서 1개가 아닌 10개의 이미지를 획득하고 평균을 구합니다. 미세소관 수축의 경우 시간 지연을 0으로 설정하고 노출 시간을 10ms로 설정하여 100fps로 이미지를 획득합니다(사용하는 카메라에 따라 관심 영역이 더 작을수록 더 높은 fps 가능).
- 4.4단계와 같이 배경 이미지를 가져옵니다.
6. 이미지 처리 및 분석
참고: 분석을 위해 이 프로토콜은 피지를 사용하지만 독자는 자신이 적합하다고 생각하는 소프트웨어를 자유롭게 사용할 수 있습니다.
- 저장된 배경 이미지를 엽니다.
- Image > Stack > Z project> Median을 사용하여 중앙값 이미지(즉, 배경)를 계산합니다.
- File > Open을 사용하여 미세소관 동역학 동영상을 스택(비동적 미세소관과 동일)으로 엽니다.
- 프로세스 > 이미지 계산기를 사용하여 스택에서 배경 이미지를 뺍니다. "32비트(플로트) 결과" 옵션을 확인하십시오.
- 동적 미세소관의 경우, line 도구를 사용하여 관심 미세소관을 따라 선을 긋고 "t"를 눌러 관심 영역 관리자에 추가합니다. 관심 있는 모든 미세소관에 대해 반복합니다.
- 동적 미세소관의 경우 Multi-Kymo 매크로를 실행합니다. 매크로는 ROI 관리자의 모든 미세소관에 대한 비디오와 카이모그래프를 생성합니다. 모든 미세소관은 고유한 식별자를 갖습니다.
- 동적 미세소관의 경우, Kymo-Analysis 매크로를 실행하고 해당 단계에 따라 미세소관의 성장률과 수축률을 측정합니다.
7. 조리개 조리개 크기
참고: IRM을 사용하여 미세소관의 고대비 이미지를 획득하기 위한 중요한 요소는 조명 개구수(INA)를 올바르게 설정하는 것입니다. INA는 AD의 크기에 의해 제어되는 대물렌즈의 출구 동공에서 들어오는 조명 빔의 크기를 변경하여 변경할 수 있습니다(AD는 대물렌즈의 출구 동공(후면 초점면)이 있는 켤레 평면에 위치함, 그림 1).
여기서 DAD는 조리개 조리개의 직경, fobjective는 objective의 초점 거리, Dep는 objective의 exit pupil diameter입니다. 일반적으로 AD는 형광 이미징을 위해 완전히 개방된 상태로 유지되므로 INA는 대물렌즈의 NA와 같습니다. 형광 현미경에서 AD 스케일은 직경을 나타내지 않으므로 INA를 계산할 수 없습니다. 대물렌즈의 도움으로 AD 크기를 보정할 수 있습니다. 그러나 AD 크기는 대비가 가장 높은 크기로 고정되므로 필요하지 않습니다.
- 표면에 붙어 있는 형광 표지된 안정화된 미세소관 샘플을 준비합니다(단계 4.1-4.2).
메모: 테트라메틸로다민 표지 미세소관(Ex: 550 nm, Em: 580 nm)을 사용했습니다.
- 형광 이미징을 수행하는 동안 현미경 초점 조절 손잡이를 사용하여 미세소관에 초점을 맞춥니다(미세소관에 레이블이 지정되지 않은 경우 IRM 또는 DIC로 이미지화).
- 카메라 소프트웨어를 사용하여 카메라 노출을 10ms로 설정합니다.
메모: 이 노출은 임의적이며 100ms의 노출도 작동합니다.
- AD를 가장 작은 구멍까지 닫습니다. 카메라의 다이나믹 레인지에 가깝게 채도가 높거나 최대로 조정되도록 조명을 조정합니다.
메모: 지침으로, 일반적으로 수집 소프트웨어에서 제공하는 조회 테이블을 사용하십시오.
- 10+ 미세소관을 포함하는 시야의 10개의 이미지(초당 스트리밍 또는 이미지 촬영)를 획득합니다.
- 4.4단계와 같이 배경 이미지를 가져옵니다.
- AD의 크기를 변경하고 전체 AD 개방 범위(닫힌 것부터 출구 동공 크기까지, 그림 7.5)에 대해 7.6-2단계를 반복합니다. AD 크기가 변경될 때마다 7.4단계와 일치하도록 조명 강도를 조정합니다.
- 획득한 모든 시야에 대해 프로세스 > 이미지 계산기를 사용하고 드롭다운 메뉴에서 "빼기"를 선택하여 해당 배경을 뺍니다. "32비트(플로트) 결과" 옵션이 선택되어 있는지 확인하십시오. 그런 다음 이미지 > 스택 > Z 프로젝트를 사용하여 결과 이미지의 평균을 구>합니다.
- 미세소관 신호의 평균 강도(미세소관의 강도에서 배경의 강도를 뺀 값)를 배경의 표준 편차로 나눈 값으로 정의되는 미세소관의 신호 대 배경 잡음비(SBR)를 측정합니다(그림 3).
- 모든 개구부 크기에 대한 미세소관의 평균 SBR을 계산하여 최적의 AD 크기(즉, 최적의 INA)를 결정하고 AD 크기를 가장 높은 SBR을 생성하는 것으로 설정합니다(그림 2). 비슷한 대비를 생성하는 다양한 AD 크기가 있을 수 있습니다.
