미세소관 역학의 Label-free 시각화를 위한 간섭 반사 현미경 검사

Abstract

출처: Mahamdeh, M., et al. 미세소관의 무표지 고속 이미징을 위한 간섭 반사 현미경 구현. J. Vis. 특급 (2019).

이 비디오에서는 적절한 완충액이 있는 커버슬립 표면에서 자라는 미세소관을 시각화하기 위한 간섭 반사 현미경(IRM) 기술에 대해 설명합니다. 입사광을 이용한 조명 시, 커버슬립-버퍼 인터페이스와 버퍼-미세소관 인터페이스는 빛을 반사하며, 이 두 인터페이스가 결합되어 간섭 패턴을 생성함으로써 미세소관을 밝은 배경에 대한 고대비 이미지로 시각화할 수 있습니다.

Protocol

1. 현미경 개조 및 대물 렌즈

1. 적절한 필터 큐브를 사용하여 형광 현미경의 필터 휠에 50/50 미러를 삽입합니다(그림 1). 50/50 거울은 반사 방지 코팅이 되어 있으므로 주의해서 다루십시오.
   메모: 우리는 현미경의 빈 필터 큐브에 50/50 거울을 사용했습니다. 50/50 미러는 다이크로익 미러가 있는 곳에 삽입됩니다.
2. 고배율/높은 개구수(NA) 오일 대물렌즈를 사용합니다.
   메모: 이 프로토콜에서는 100x/1.3 NA 대물렌즈를 사용했습니다.

2. 미세소관을 표면에 부착하기 위한 챔버 준비

1. 깨끗한 현미경 슬라이드와 22mm x 22mm 커버슬립(정립 현미경용) 또는 22mm x 22mm 및 18mm x 18mm 커버슬립(도립 현미경용). 필요에 따라 지표면을 수정합니다. 예를 들어ample, 알칼리성 세제(재료 표 참조)를 사용하여 커버슬립을 청소한 다음 그 사이와 그 후에 증류수로 100% 에탄올을 세척합니다.
2. 면도날과 다른 현미경 슬라이드를 가....

Results

그림 1. IRM의 개략적 표현. (A) 광원의 에피 조명은 50/50 미러에 도달하기 전에 조리개 조리개를 통과합니다. 조리개 조리개는 빔 폭을 설정하여 조명 NA를 설정합니다. 50/50 미러는 대물렌즈까지 빛을 부분적으로 반사하여 샘플을 비춥니다. 샘플에서 반사된 빛은 수집된 다음 카메라 칩(튜브 렌즈에 의해)에 투사되어 이미지 생성을 방해합니다. 이미지 대비는 유리/물 계면(I1)에서 반사된 빛과 물/미세소관 계면(I2)에서 반사된 빛 사이의 간섭의 결과입니다. 미세소관/표면 거리(h)에 따라 I1과 I2 사이의 광학 경로 차이는 건설적(밝은 신호) 또는 파괴적(어두운 신호) 또는 그 사이의 모든 것을 초래합니다. 예를 들어, 파장이 600nm인 빛을 이미징에 사용하는 경우 미세소관 높이가 약 100nm 변하면 대비가 어둡고 밝음 사이에서 전환됩니다. 별표는 켤레 평면을.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
현미경	니콘	티이클립	유출물을 수행하는 데 사용되는 도립 현미경
50/50 빔 스플리터	크로마	21000	구매할 때 현미경에 사용된 큐브에 맞는 스플리터 치수를 선택해야 합니다.
NIKON PLAN FLUOR 100X/0.5-1.3 조리개 대물렌즈	니콘	MRH02902	이미징 대물렌즈. 이 대물렌즈에는 NA 1.3에 개방된 NA 조정 홍채가 있습니다.
Mucasol 범용 세제	시그마-알드리치	Z637181-2L	커버 슬립 및 슬라이드 청소에 사용
플라스틱 파라핀 필름(상업명 Parafilm M)	시그마-알드리치	P7793	흐름 채널을 구성하는 데 사용됩니다.
항-TAMRA 항체	인비트로젠	A-6397	TAMRA 표지 분자(예: 미세소관)를 시료 표면에 결합하는 데 사용됩니다. RRID (AB_2536196)
폴록사머 407 (상업명 플루로닉 F-127)	시그마-알드리치		비특이적 결합을 방지하기 위해 채널 표면을 차단하는 데 사용됩니다.
40nm 금 나노 입자	시그마-알드리치	753637	대조군 샘플로 사용
20nm 금 나노 입자	시그마-알드리치	753610	대조군 샘플로 사용
Zyla 4.2 카메라	안도르	자일라 4.2	2048x2048 픽셀(6.5μm 픽셀 크기), 양자 효율 72% 및 16비트 다이내믹 레인지
Feista 추적 소프트웨어			https://www.bcube-dresden.de/ fiesta/wiki/FIESTA
안정화된 미세소관			사내에서 준비(텍스트의 참조 참조)