조립된 뉴클레오솜을 시각화하고 특성화하기 위한 정적 원자력 현미경 검사

Abstract

출처: Stormberg, T., et al. 원자력 현미경 이미징을 사용하여 뉴클레오솜의 구조 및 역학 조사. J. Vis. 특급(2019년)

이 비디오에서는 조립된 뉴클레오솜을 시각화하기 위한 정적 원자력 현미경을 시연합니다. 이 고해상도 이미징 기술을 통해 뉴클레오솜 구조를 연구할 수 있습니다.

Protocol

1. 뉴클레오솜의 정적 AFM 이미징을 위한 운모 표면의 기능화

1. 설명된 대로 탈이온수에 50mM 1-(3-Aminopropyl) silatrane APS 스톡 용액을 준비합니다. 이 용액의 1mL 부분 표본을 사용할 때까지 4°C에서 보관하십시오.
   메모: 부분 표본은 4°C에서 1년 이상 보관할 수 있습니다.
2. 50mM APS 스톡의 50μL를 15mL dd H₂O.
   에 용해하여 운모 변형을 위한 작동 중인 APS 1:300 용액을 준비합니다. 메모: 이 작업 솔루션은 실온에서 며칠 동안 보관할 수 있습니다.
3. 고품질 운모 시트에서 1 x 3cm 운모 스트립을 자릅니다(여기에 사용된 운모에 대한 재료 표 참조).
   1. 조각이 큐벳에 대각선으로 놓일 때 맞는지 확인하십시오. 날카로운 핀셋 끝, 면도날 또는 스카치 테이프를 사용하여 운모 층을 양쪽이 새로 절단되고 조각이 ~0.1mm만큼 얇아질 때까지 운모 층을 절단합니다(그림 1A). 즉시 운모 조각을 APS가 채워진 큐벳에 넣고 30분 동안 배양합니다(그림 1B).
4. 운모 조각을 dd H2O로 채워진 큐벳에 옮기고 30초 동안 담가둡니다(그림 1C). 아르곤 흐름에서 APS-운모 스트립의 양쪽을 완전히 건조시킵니다.
   메모: 부직포 셀룰로오스 및 폴리에스터 클린룸 와이프(권장 와이프는 재료에 자세히 설명되어 있음)를 사용하여 건조 시 운모 가장자리에서 물을 흡수하는 데 도움이 될 수 있습니다.
5. 이제 샘플 준비를 위해 건조 운모 스트립을 사용하십시오. 그렇지 않으면 깨끗하고 건조한 큐벳에 조각을 보관하십시오(그림 1D).
   메모: 환경이 습할 경우 1-2시간 동안 진공 상태에서 추가로 보관하는 것이 좋습니다. 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.

2. 정적 AFM 이미징을 위한 APS-Mica의 뉴클레오솜 샘플 준비

1. 여러 개의 마그네틱 퍽에 양면 접착 테이프를 바르고 측면에 놓습니다.
2. APS-mica 기판을 원하는 크기(여기에 사용된 MM AFM 기기의 경우 1 x 1cm 정사각형)로 자릅니다. 이 조각들을 깨끗한 페트리 접시에 넣고 덮어 두십시오.
3. 10mM HEPES pH 7.5 및 4mM MgCl₂.
   를 포함하는 0.22μm 여과된 완충액을 사용하여 조립된 뉴클레오솜(최종 뉴클레오솜 농도 0.5, 1.0 및 2.0nM)의 3가지 희석액을 준비합니다 메모: 낮은 최종 농도에서 뉴클레오솜의 손실을 제한하기 위해, 희석은 APS-운모에 증착하기 직전에 한 번에 하나씩 수행해야 합니다.
4. 희석된 뉴클레오솜 샘플 5-10 μL를 APS-운모 조각의 중앙에 놓고 2분 동안 배양합니다. 샘플을 2-3mL의 dd H₂O로 부드럽게 헹구어 모든 완충액 성분을 제거합니다. dd H₂O를 ~0.5mL 사용할 때마다 운모를 부드럽게 흔들어 과도한 헹굼 물을 제거합니다.
   메모: 이 헹굼 단계에는 일회용 주사기를 사용하는 것이 좋습니다.
5. 깨끗한 아르곤 가스의 가벼운 흐름에서 증착된 샘플을 건조시킵니다.
   메모: 이제 샘플을 이미징할 준비가 되었거나 아르곤으로 채워진 진공 캐비닛 또는 데시케이터에 보관할 수 있습니다. 설명된 대로 준비 및 보관된 샘플은 품질 손실 없이 준비 후 1년 후에 이미지화되었습니다. 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.

3. 뉴클레오솜의 정적 AFM 이미징

1. 팁 홀더에 AFM 팁을 장착합니다. 스프링 상수가 ~40N/m이고 공진 주파수가 300kHz에서 340kHz 사이인 팁을 사용하십시오(여기에 사용된 캔틸레버에 대한 재료 표 참조).
2. 섹션 3에서 준비한 샘플을 AFM 스테이지에 장착하고 샘플 표면에 닿지 않도록 주의합니다.
3. 합계가 최대가 될 때까지 캔틸레버 위에 레이저를 배치하고 수직 및 측면 편향 값을 거의 0으로 조정합니다.
4. AFM 프로브를 조정하여 공진 주파수를 찾고 구동 진폭을 조정하고 이미지 크기를 100 x 100nm로 설정합니다. 참여 버튼을 클릭하여 접근 방식을 시작합니다.
5. 일단 접근하면 샘플 표면이 명확하게 보일 때까지 진폭 설정점을 점차적으로 최적화합니다. 스캔 크기를 1 x 1μm로 늘리고 해상도를 512 x 512 픽셀로 늘립니다. 캡처 버튼과 참여 버튼을 차례로 클릭하여 이미지 획득을 시작합니다.
   메모: 그림 2의 이미지는 이러한 샘플을 이미징할 때 기대할 수 있는 부드러운 배경을 보여줍니다.

Results

그림 1: 뉴클레오솜의 AFM 이미징을 위해 APS 기능화된 운모를 준비하는 프로세스의 개략도.(A) ~0.1mm 두께의 운모 조각은 양면이 갓 절단되어 있습니다. (B) 절단된 운모 조각을 APS 용액이 들어 있는 큐벳에 대각선으로 즉시 놓고 30분 동안 배양하도록 설정합니다.(C) APS 기능화 단계에 따라 APS-운모 조각을 dd H2O로 채워진 큐벳으로 옮겨 30초 동안 헹굽니다. (D) APS-운모 조각은 사용할 때까지 큐벳에 보관합니다.

그림 2: H3 및 CNEP-A 뉴클레오솜의 AFM 이미지 예.(

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CENP-A/H4)2, 재조합 인간	EpiCypher, 노스캐롤라이나주 더럼	제16-0010	카탈로그 번호 50 ug
H2A/H2B, 재조합 인간	EpiCypher, 노스캐롤라이나주 더럼	제15-0311	카탈로그 번호 50 ug
H3 옥타머, 재조합 인간	EpiCypher, 노스캐롤라이나주 더럼	제16-0001	카탈로그 번호 50 ug
Slide-A-Lyzer MINI 투석 기기 키트, 10K MWCO, 0.1 mL	ThermoFischer Scientific, 매사추세츠주 월섬	69574	10개 장치에 대한 카탈로그 번호
소금	시그마-알드리치, 미주리주 세인트루이스	S9888-500G	카탈로그 번호 500 mg
Amicon Ultra-0.5 mL 원심분리 필터	Millipore-sigma, 벌링턴, 미주리	UFC501008	8개 장치에 대한 카탈로그 번호
염산(HCl)	시그마-알드리치, 미주리주 세인트루이스	258148-25ML	카탈로그 번호 25 mL
트리신	시그마-알드리치, 미주리주 세인트루이스	T0377-25G	카탈로그 번호 25 g
증권 시세	시그마-알드리치, 미주리주 세인트루이스	11667289001	카탈로그 번호 1 kg
과황산암모늄(AmmPS)	Bio-Rad, 허큘리스, 캘리포니아	1610700	카탈로그 번호 10 g
30% 아크릴아미드/비스 용액, 37.5:1	Bio-Rad, 허큘리스, 캘리포니아	1610158	카탈로그 번호 500 mL
테마드	Bio-Rad, 허큘리스, 캘리포니아	1610800	카탈로그 번호 5 mL
SDS-PAGE용 Laemmli 단백질 시료 완충액 4개	Bio-Rad, 허큘리스, 캘리포니아	1610747	카탈로그 번호 10 mL
2-ME	시그마-알드리치, 미주리주 세인트루이스	M6250-10ML	카탈로그 번호 10 mL
ageRuler Prestained 단백질 래더	ThermoFischer Scientific, 매사추세츠주 월섬	26616	카탈로그 번호 500 uL
바이오 안전™ Coomassie 염색	Bio-Rad, 허큘리스, 캘리포니아	1610786	카탈로그 번호 1 L
부직포 클린룸 물티슈: TX604 TechniCloth	TexWipe, 케르너스빌, 노스캐롤라	TX604
백운모 블록 운모	AshevilleMica, 뉴포트 뉴스, 버지니아	1등급
헤페스	시그마-알드리치, 미주리주 세인트루이스	H4034-25G	카탈로그 번호 25 g
스카치 테이프	Scotch-3M, 세인트폴, MN
TESPA-V2 afm 프로브(정적 이미징용)	Bruker AFM 프로브, 캘리포니아 카마릴로
Millex-GP 필터, 0.22 μm	시그마-알드리치, 미주리주 세인트루이스	SLGP05010	10개 장치에 대한 카탈로그 번호
BL-AC10DS-A2 afm 프로브(HS-AFM용)	올림푸스, 일본
다중 모드 원자력 현미경	Bruker-Nano/Veeco, 산타바바라, CA