뉴클레오솜 역학을 포착하기 위한 고속 타임랩스 원자력 현미경

초록

출처: Stumme-Diers, M. P., et al., 원자력 현미경 이미징을 사용하여 뉴클레오솜의 구조 및 역학 조사.J. Vis. 특급(2019년)

이 비디오에서는 뉴클레오솜 복합체의 역학을 연구하기 위한 고속 저속 원자력 현미경, AFM, 이미징 기술을 시연합니다. AFM 팁은 뉴클레오솜 표면을 스캔하면서 뉴클레오솜 높이의 변화를 감지하고 시간이 지남에 따라 DNA가 풀리는 것을 기록합니다.

프로토콜

1. 모노 뉴클레오솜의 연속 희석 조립

1. 중심을 벗어난 Widom 601 뉴클레오솜 포지셔닝 서열을 포함하는 약 400bp DNA 기질을 생성하고 정제합니다.
   메모: 원치 않는 디뉴클레오솜 형성을 제한하려면 포지셔닝 시퀀스 옆에 있는 각 '팔'이 ~150bp를 초과해서는 안 됩니다.
   1. 설계된 프라이머와 함께 plasmid pGEM3Z-601을 사용하고 PCR을 사용하여 기질 DNA를 증폭합니다. 여기에 사용된 122 및 154 bp arm 길이의 423 bp 기판의 경우 정방향(5'-CAGTGAATTGTAATACGACTC-3') 및 역방향(5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3') 프라이머를 사용합니다.
   2. 반응 혼합물이 들어있는 튜브를 95 ° C로 예열 된 열 순환기에 추가합니다. 95 ° C에서 5 분 동안 초기 변성 후 33 사이클 동안 다음 프로그램을 실행합니다 : 95 ° C에서 30 초 변성, 49 ° C에서 30 초 어닐링, 72 ° C에서 35 초 연장. 33 사이클 후 10 분 동안 72 ° C에서 최종 연장을 설정합니다.
   3. 시판되는 PCR Purification Kit를 사용하여 PCR 혼합물에서 DNA를 정제합니다. PCR 클린업 컬럼에서 DNA를 용리할 때 키트에서 제공하는 용리 완충액 대신 10mM Tris 완충액(pH 7.5)을 사용합니다.
      메모: 정제 단계 간에 버퍼를 전송하지 않도록 각별히 주의하십시오. 오염된 용리액은 DNA 농도를 측정할 때 다운스트림에서 문제를 일으키거나 뉴클레오솜 어셈블리 혼합물의 시작 염 농도를 변경할 수 있습니다.
2. 260 nm에서 정제된 DNA의 흡광도를 측정하여 DNA 농도를 측정합니다.
   1. 10 mM Tris pH 7.5 용리 완충액만을 사용하여 UV VIS 분광광도계에서 블랭크를 수집합니다. 정제된 DNA의 측정값을 수집합니다.
3. 농도가 결정되면 정제된 DNA의 분취량 25 pmol을 0.6 mL 마이크로분리 튜브에 넣고 용액이 거의 보이지 않을 때까지 진공 원심분리기에 넣습니다. 이는 일반적으로 30분에서 1시간
   입니다. 메모: 이제 DNA 기질이 뉴클레오솜 조립을 할 준비가 되었습니다. 그렇지 않으면 여기에서 프로토콜을 일시 중지하고 DNA를 사용할 때까지 -20°C에서 보관할 수 있습니다.
4. 25 pmol DNA가 들어있는 마이크로분리 튜브를 얼음 위에 놓고 표 1의 뉴클레오솜 조립 성분을 나열된 순서대로 추가합니다. 모든 성분이 추가되면 얼음에서 혼합물을 제거하고 실온(RT)에서 30분 동안 배양합니다.
   메모: 2M 최종 농도를 달성하는 데 필요한 NaCl을 계산할 때 스톡 히스톤 버퍼의 염 함량을 고려하는 것이 중요합니다.
5. 연속 속도 희석을 사용하여 혼합물의 2M 염 농도를 200mM로 줄여 뉴클레오솜을 조립합니다.
   1. 10mM Tris pH 7.5를 함유한 100μL의 희석 완충액을 주사기에 채우고 주사기 펌프에 놓습니다.
   2. 마이크로퓨지 튜브의 캡에 미리 뚫린 구멍을 통해 주사기의 바늘을 통과시켜 어셈블리 혼합물과 접촉하도록 합니다(그림 1).
   3. 주사기 펌프를 120분 동안 0.75μL/분의 속도로 가동합니다.
      메모: 생성된 100μL 용액에는 250nM 뉴클레오솜과 200mM NaCl이 포함되어 있습니다.
   4. 혼합물을 10K MWCO 투석 버튼으로 옮기고 200°C에서 10시간 동안 10mM Tris pH 7.5, 0.25mM EDTA 및 2.5mM NaCl을 포함하는 사전 냉각(4°C) 저염 완충액 2mL에 대해 투석합니다.
6. 뉴클레오솜 어셈블리의 히스톤 함량을 평가하기 위해, 앞서 설명한 바와 같이 15% 분리 및 6% 적층으로 불연속 SDS-PAGE 겔을 준비합니다.
   1. 10 - 20 μL의 뉴클레오솜 스톡을 마이크로분리 튜브에 분취하고 4x Laemmli Sample Buffer를 1 - 2x의 작업 농도로 추가합니다.
   2. 대조군으로, 히스톤 스톡의 1 - 2 μg에 대해 별도의 마이크로분리 튜브에서 이 준비를 반복합니다. 샘플을 95°C에서 ~ 5분 동안 가열합니다.
   3. 인접한 레인에 있는 샘플을 겔에서 서로 로드합니다. 사용하지 않는 레인에 샘플 버퍼를 추가하여 균일한 대역 이동을 촉진합니다.
   4. 염료 전면이 스태킹 젤을 통과할 때까지 65V에서 젤을 실행합니다. 분리 젤에 도달하면 150V로 높이고 염료 선단이 겔 밖으로 완전히 이동할 때까지 실행합니다.
   5. 전기영동 장치를 분해하고 dd H₂O로 채워진 염색 용기에 겔을 부드럽게 옮깁니다. 젤을 부드럽게 저어주면서 5분 동안 그대로 두십시오. 매번 새로운 dd H₂O를 사용하여 이 과정을 두 번 더 반복합니다.
      메모: 이 프로토콜에 사용된 Coomassie 염색은 Coomassie 염색에 필요한 일반적인 고정 단계가 필요하지 않습니다(재료 표 참조). 다른 Coomassie 제제를 사용하는 경우 필요에 따라 고정 단계를 조정하십시오.
   6. 최종 헹굼에서 물을 제거하고 젤을 덮을 만큼만 얼룩을 추가합니다. 젤을 최소 1시간 동안 부드럽게 저어주어 그대로 둡니다.
      메모: 교반을 위해 염색 용기는 젤을 액체로 덮은 상태로 유지하면서 젤 위의 염색 이동을 촉진하는 모든 장치에 놓을 수 있습니다.
   7. 용기에서 얼룩을 제거하고 dd H₂O로 젤을 헹굽니다.dd H₂O를 교체하고 부드러운 교반으로 젤을 30 분 동안 담그십시오. (젤은 히스톤 밴드의 명확한 분리와 함께 그림 2에 표시된 것과 같이 나타나야 합니다.)
7. 뉴클레오솜을 사용할 때까지 4°C에서 보관하십시오.
   메모: 이러한 조건에서 보관하면 뉴클레오솜은 몇 달 동안 안정적으로 유지됩니다. 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.

2. 뉴클레오솜 역학의 고속 타임랩스 AFM 이미징

참고: 아래 프로토콜은 Ando 그룹(일본 가나자와, 가나자와 대학)에서 개발한 HS-AFM 기기용으로 제공됩니다.

1. 액체 이미징을 위한 APS-운모를 준비합니다.
   1. 유리 막대를 AFM 스캐너 s에 부착tage 유리 막대-스캐너 접착제를 사용합니다(재료 표 참조). 최소 10분 동안 건조시키십시오.
   2. 더 큰 운모 시트에서 펀칭하여 직경 1.5mm의 ~0.1mm 두께의 원형 운모 조각을 만듭니다. HS-AFM 운모 유리 막대 접착제(재료 표 참조)를 사용하여 이 운모 조각을 HS-AFM의 유리 막대에 부착하고 최소 10분 동안 손대지 않고 건조시킵니다. 테이프에서 잘 절단된 층이 보일 때까지 압력에 민감한 테이프를 사용하여 층을 절단합니다.
   3. 500μM APS 용액 99μL에 50mM APS 스톡 1μL를 희석합니다. 이 용액 2.5μL를 갓 절단한 운모 표면에 증착하고 30분 동안 기능화시킵니다.
      메모: 기능적으로 작동하는 동안 표면이 건조해지는 것을 방지하기 위해 50mL 원뿔형 원심분리기 튜브의 캡을 젖은 여과지 조각에 끼워 스캐너 위에 놓을 수 있습니다. APS 스톡은 AFM으로 관찰할 수 있는 속도로 역학을 제어하기 위해 정적 이미징보다 액체 이미징의 경우 3배 적게 희석됩니다.
   4. ~3μL 헹굼을 여러 번 적용하여 20μL의 dd H₂O로 운모를 헹굽니다. 헹굴 때마다 운모 가장자리에 부직포 물티슈를 놓아 물을 완전히 제거하십시오. 최종 헹굼 후, ~3 μL의 dd H₂O를 표면에 놓고 특이적으로 결합되지 않은 APS를 제거하기 위해 최소 5분 동안 그대로 두십시오.
2. 프로브를 HS-AFM 홀더에 놓고 홀더를 AFM s에 배치합니다.tage 팁이 위를 향하도록 합니다. ~100μL의 dd H₂O를 사용하여 홀더를 헹구고 10mM HEPES pH 7.5 및 4mM MgCl₂를 포함하는 0.22μm 여과된 뉴클레오솜 이미징 버퍼를 ~100μL 2회 헹굽니다.
3. 헹굼이 완료되면 챔버를 ~100μL의 뉴클레오솜 이미징 버퍼로 채우고 팁을 담그십시오. 레이저에 부딪힐 때까지 캔틸레버 위치를 조정하십시오. 헹굼 당 ~4 μL를 사용하여 20 μL의 필터링된 뉴클레오솜 이미징 버퍼로 APS-mica를 헹굽니다.
4. 1 μL의 뉴클레오솜 어셈블리 스톡을 250 μL의 여과된 뉴클레오솜 이미징 버퍼에 희석하여 1 nM의 최종 뉴클레오솜 농도를 얻습니다. 이 희석액 2.5μL를 표면에 증착하고 2분 동안 그대로 둡니다. ~ 4 μL의 뉴클레오솜 이미징 버퍼로 표면을 두 번 헹굽니다. 최종 헹굼 후 표면을 이미징 버퍼로 덮은 상태로 둡니다.
   메모: 뉴클레오솜 샘플을 침착한 후 표면을 헹구지 않으면 표면이 급격히 과밀화됩니다.
5. 스캐너와 s를 설정하십시오.ample가 앞면이 아래를 향하도록 팁 홀더 위에 놓습니다. 접근을 시작하려면 설정점 진폭 A_s가 자유 진동 진폭 A₀에 가까운 자동 접근 기능을 사용합니다.
   메모: 이상적으로는 A_s = 0.95 A₀이지만 주의하면 A₀의 82%에서 작동하는 것도 잘 작동합니다.
6. 표면이 잘 추적될 때까지 설정점을 조정합니다.
   메모: AFM 팁에서 뉴클레오솜 샘플로의 에너지 전달을 최소화하려면 캔틸레버의 진폭을 작게 유지하고 진폭을 1nm만큼 낮게 유지해야 합니다.
7. 이미징 프레임당 ~300ms의 데이터 수집 속도로 이미지 영역을 약 150 x 150nm에서 200 x 200nm로 설정합니다.
   메모: 이 이미지 크기는 일반적으로 여러 뉴클레오솜의 역학을 동시에 캡처하기에 충분합니다. 인구가 적은 표면은 이러한 매개변수를 변경해야 할 수 있습니다. 제안된 프레임 속도는 무엇보다도 루핑(looping), 슬라이딩(sliding), 언래핑(unwrapping)과 같은 뉴클레오솜 역학을 캡처하기에 충분합니다(아래의 대표 결과 섹션 참조).

표 1: 연속 염 구배 뉴클레오솜 조립에 필요한 시약. 나열된 각 구성 요소는 정제된 DNA를 포함하는 마이크로분리관에 추가됩니다. 이것은 물과 NaCl을 먼저 첨가한 다음 H2A/H2B 이량체와 히스톤 사합체를 마지막으로 첨가하여 시약이 표에 나열된 순서대로 수행되어야 합니다. 미리 접힌 히스톤 옥타머를 사용하는 경우 위의 사합체와 동일한 비율로 추가하십시오. * 각 히스톤 스톡의 NaCl 함량을 기록하고 그에 따라 5M NaCl을 조정하여 최종 [NaCl]은 2M과 같아야합니다 (재료 표 참조).

결과

그림 1: 마이크로 뉴클레오솜 조립에 사용되는 주사기 펌프의 개략도.조립 혼합물은 주사기 바늘의 끝과 접촉하도록 배치됩니다. 희석 완충액이 주사기 펌프에 의해 조립 혼합물로 전달됨에 따라 NaCl의 농도가 감소하여 뉴클레오솜 조립이 촉진됩니다. 이 그림은 Stumme-Diers et al.에서 발췌한 것입니다.

그림 2: 조립된 뉴클레오솜의 SDS-PAGE. 레인 1과 2에는 각각 H3 옥타머와 히스톤의 CENP-A 어셈블리가 포함되어 있습니다. 레인 3과 4에는 각각 조립된 H3 뉴클레오솜과 조립된 CENP-A 뉴클레오솜이 포함되어 있습니다. 조립된 뉴클레오솜...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
플라스미드 pGEM3Z-601	Addgene, 매사추세츠주 케임브리지	26656
PCR 프라이머	IDT, 코럴빌, 아이오와	맞춤 주문	(FP) 5'- CAGTGAATTGTAATACGACTC-3' (RP) 5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3'
DreamTaq 중합효소	ThermoFischer Scientific, 매사추세츠주 월섬	제0701	200개 단위의 카탈로그 번호
PCR 정제 키트	Qiagen, Hilden, 독일	28104	50개 단위의 카탈로그 번호
트리스 베이스	시그마-알드리치, 미주리주 세인트루이스	10708976001	카탈로그 번호 250 g
에디타	ThermoFischer Scientific, 매사추세츠주 월섬	15576028	카탈로그 번호 500 g
(CENP-A/H4)2, 재조합 인간	EpiCypher, 노스캐롤라이나주 더럼	제16-0010	카탈로그 번호 50 ug
H2A/H2B, 재조합 인간	EpiCypher, 노스캐롤라이나주 더럼	제15-0311	카탈로그 번호 50 ug
H3 옥타머, 재조합 인간	EpiCypher, 노스캐롤라이나주 더럼	제16-0001	카탈로그 번호 50 ug
Slide-A-Lyzer MINI 투석 기기 키트, 10K MWCO, 0.1 mL	ThermoFischer Scientific, 매사추세츠주 월섬	69574	10개 장치에 대한 카탈로그 번호
소금	시그마-알드리치, 미주리주 세인트루이스	S9888-500G	카탈로그 번호 500 mg
Amicon Ultra-0.5 mL 원심분리 필터	Millipore-sigma, 벌링턴, 미주리	UFC501008	8개 장치에 대한 카탈로그 번호
염산(HCl)	시그마-알드리치, 미주리주 세인트루이스	258148-25ML	카탈로그 번호 25 mL
트리신	시그마-알드리치, 미주리주 세인트루이스	T0377-25G	카탈로그 번호 25 g
증권 시세	시그마-알드리치, 미주리주 세인트루이스	11667289001	카탈로그 번호 1 kg
과황산암모늄(AmmPS)	Bio-Rad, 허큘리스, 캘리포니아	1610700	카탈로그 번호 10 g
30% 아크릴아미드/비스 용액, 37.5:1	Bio-Rad, 허큘리스, 캘리포니아	1610158	카탈로그 번호 500 mL
테마드	Bio-Rad, 허큘리스, 캘리포니아	1610800	카탈로그 번호 5 mL
SDS-PAGE용 Laemmli 단백질 시료 완충액 4개	Bio-Rad, 허큘리스, 캘리포니아	1610747	카탈로그 번호 10 mL
2-ME	시그마-알드리치, 미주리주 세인트루이스	M6250-10ML	카탈로그 번호 10 mL
PageRuler Prestained 단백질 래더	ThermoFischer Scientific, 매사추세츠주 월섬	26616	카탈로그 번호 500 uL
바이오 안전™ Coomassie 염색	Bio-Rad, 허큘리스, 캘리포니아	1610786	카탈로그 번호 1 L
부직포 클린룸 물티슈: TX604 TechniCloth	TexWipe, 케르너스빌, 노스캐롤라	TX604
백운모 블록 운모	AshevilleMica, 뉴포트 뉴스, 버지니아	1등급
아미노프로필 실라트라인(APS)	22에 설명된 대로 합성됨
헤페스	시그마-알드리치, 미주리주 세인트루이스	H4034-25G	카탈로그 번호 25 g
스카치 테이프	Scotch-3M, 세인트폴, MN
아론 알파 인더스트리얼 크레이지 글루	Toagosei America, 웨스트 제퍼슨, 오하이오	AA480	카탈로그 번호 2 g 튜브
마그네슘Cl2	시그마-알드리치, 미주리주 세인트루이스	M8266-100G	카탈로그 번호 100 g
Millex-GP 필터, 0.22 μm	시그마-알드리치, 미주리주 세인트루이스	SLGP05010	10개 장치에 대한 카탈로그 번호
BL-AC10DS-A2 afm 프로브(HS-AFM용)	올림푸스, 일본
화합물 FG-3020C-20	FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japan
화합물 FS-1010S135-0.5	FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japan
고속 타임랩스 원자력 현미경	Toshio Ando, Nano-Life Science Institute, Kanazawa University, Kakuma-machi, Kanazawa, Japan