인간 골격근의 글리코겐 분포를 정량화하기 위한 투과 전자 현미경

인간 참가자와 관련된 모든 절차는 인간 복지를 위한 기관, 국가 및 국제 지침에 따라 수행되었으며 지역 기관 검토 위원회의 검토를 거쳤습니다.

1. 1차 고정, 사후 고정, 임베딩, 절편 및 대조

1. 2mL 마이크로 원심분리 튜브에 1.6mL의 1차 고정 용액(0.1M 카코딜레이트 나트륨 완충액(pH 7.3)의 2.5% 글루타르알데히드)를 준비합니다. 5°C에서 최대 14일 동안 보관하십시오.
2. 근육 생검 또는 전체 근육에서 모든 방향으로 최대 직경이 1mm이고 단면보다 세로 섬유 방향에서 약간 더 긴 작은 표본을 분리하십시오(방향 목적으로).
3. 차가운 1차 고정 용액이 들어 있는 튜브에 표본을 놓습니다. 5°C에서 24시간 동안 보관하십시오.
4. 0.1M 카코딜레이트 나트륨 완충액(pH 7.3)에서 표본을 4회(각 세척 사이에 15분) 세척합니다. 전사 피펫을 사용하여 샘플은 그대로 두고 튜브에서 사용한 버퍼를 제거한 다음 새 버퍼를 추가합니다.
   메모: 최종 세척 후 검체는 5°C의 0.1M 카코딜레이트 나트륨 완충액에 몇 달 동안 보관할 수 있습니다. 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.
5. 0.1M 카코딜레이트 나트륨 완충액(pH 7.3)에 1% 사산화오스뮴(OsO₄) 및 1.5% 페로시안화칼륨(K₄Fe(CN)₆)을 4°C에서 120분 동안 사용한 후미
   메모: 1.5% 페로시아나이드 칼륨(_K4Fe(CN)₆)의 사용은 글리코겐 입자의 최적 대비를 위해 필수적입니다.
6. 실온(RT)에서 이중 증류수로 두 번 헹굽니다.
7. 70%(10분), 70%(10분), 95%(10분), 100%(10분) 및 100%(10분) 농도를 사용하여 RT에서 등급이 매겨진 일련의 알코올(에탄올)에 담가 탈수합니다.
   메모: 각 단계에서 시편을 에탄올에 담그고 에탄올을 제거한 후 시편이 건조되지 않도록 부분적으로만 제거됩니다. 마지막으로 남은 에탄올은 폐기됩니다.
다음
8. 부피 비율(프로필렌 옥사이드/에포시딕 수지)을 사용하여 RT에서 프로필렌 옥사이드와 에포시딕 수지의 등급별 혼합물로 침투합니다: 1/0 (10분), 1/0 (10분), 3/1 (45분), 1/3 (45분), 0/1 (밤새). 다음 날, 100% 신선한 에포시딕 수지에 표본을 금형에 삽입하고 60°C에서 48시간 동안 중합합니다.
9. 세로 방향 광섬유의 초박형(60-70nm) 부분을 절단하고 다음과 같이 단일 구멍 구리 그리드에 수집합니다.
   1. 초박 절편기 홀더에 표본 블록을 장착합니다.
   2. 조직의 수준에 도달하기 위해 면도날로 표면의 블록을 다듬습니다.
   3. 샘플 앞에 다이아몬드 나이프(울트라 컷 45)를 장착하고 샘플 표면을 나이프와 평행하게 정렬합니다.
   4. 다이아몬드 나이프로 반박형(1μm) 절편을 만들어 샘플의 방향을 확인합니다. 광학 현미경으로 관찰하기 위해 반박형 부분을 톨루이딘 블루로 염색합니다.
   5. 적절한 초박형 단면을 얻기 위해 관심 영역을 줄이기 위해 블록을 더 자릅니다.
   6. 두 번째 다이아몬드 나이프(울트라 컷 45)로 초박형(60-70nm) 섹션을 자릅니다.
   7. Perfect Loop를 사용하여 1홀 구리 그리드에서 1-2개의 섹션을 수집합니다.
      메모: 1홀 구리 그리드는 중간에 단일 구멍이 있으며 Formvar가 멤브레인을 지지합니다.
10. 위의 그리드를 우라닐 아세테이트 용액(이중 증류수 중 0.5%)에 20분 동안 담근 다음 구연산납 용액(이중 증류수 중 1%)에 15분 동안 담궈 우라닐 아세테이트 및 구연산납과 대조합니다. 두 얼룩 사이와 그 후에 이중 증류수로 그리드를 세척합니다.
    메모: 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.

2. 이미징

1. 투과 전자 현미경(가속 볼륨에서 작동)을 켭니다.tage 80kV), 컴퓨터 및 이미지 기록 소프트웨어. 디지털 슬로우 스캔 2k x 2k CCD 카메라 및 관련 이미징 소프트웨어를 사용하여 디지털 이미지를 기록합니다.
2. 현미경 스테이지에 여러 섹션이 있는 그리드를 삽입합니다.
3. 초기에 저배율(예: x100)에서 그리드를 스크리닝하여 단면(즉, 지지 멤브레인의 구멍, 파편 등)의 품질을 결정하고 최상의 품질 단면을 선택합니다. 낮은 배율에서 근섬유의 방향을 결정합니다.
4. 다음으로, 단면의 주변 광섬유를 중심으로 하는 빔으로 배율을 높입니다. 30k 이상의 배율에서 이미지의 초점을 맞추어 가능한 경우 Real-Time Fast Fourier Transformation에 의해 안내되는 이미지의 미세한 디테일을 충분히 확보합니다. 마지막으로 원하는 배율에서 1초의 노출 시간으로 이미지를 기록합니다.
5. 무작위로 선택된 섬유의 총 24개 이미지, 즉 근섬유의 이미지 12개와 근섬유하 공간의 이미지 12개를 10k에서 40k 사이의 배율로 획득합니다. 편향되지 않은 결과를 얻기 위해 이미지가 무작위이지만 체계적인 순서로 섬유의 길이와 너비에 걸쳐 분포되어 있는지 확인합니다(그림 1A).
   메모: 최적의 배율은 사용 가능한 카메라 해상도와 현미경 사진의 크기에 따라 다릅니다. 목표는 글리코겐 입자 직경을 1nm 단계 내에서 측정할 수 있는 최종 해상도를 달성하고, 최소 70μm2의 근섬유질 영역의 총 면적과 최소 25μm의 섬유의 총 길이를 근섬유의 12개의 이미지와 섬유당 근섬유하의 12개의 이미지로 분포하는 것을 포함하는 것입니다. 각각. 섬유당 24개의 이미지는 인간, 쥐 및 생쥐의 골격근에서 개별 섬유에서 0.1에서 0.2 사이의 서로 다른 글리코겐 풀의 부피 함량에 대한 정밀도(오차 계수)를 제공할 가능성이 가장 높습니다(그림 2E).
6. 총 6-10개의 광섬유가 이미지화될 때까지 2.4단계와 2.5단계를 반복합니다. 필요한 경우 추가 절편을 자르고(이미 이미징된 섬유의 중복을 피하기 위해 최소 150μm로 분리됨) 1.9-2.5단계를 반복합니다.

3. 이미지 분석

1. File > Open을 클릭하여 이미지를 ImageJ로 가져옵니다.
2. Analyze(분석) > Set Scale(스케일 설정)을 클릭하여 이미지의 원래 크기와 일치하도록 전역 스케일을 설정합니다.
3. 이미지를 클릭하여 100% 확대> Zoom > In을 클릭합니다.
4. Tools 메뉴의 Straight Line 도구를 사용하여 근섬유질 공간(섬유당 12개)의 이미지당 하나의 Z-디스크 두께를 측정합니다(그림 1D). 6-10 개 섬유 각각의 평균 Z 디스크 두께를 계산합니다.
5. 평균 Z 디스크가 가장 두꺼운 2-3 섬유를 유형 1 섬유로, 평균 Z 디스크가 가장 얇은 2-3 섬유를 유형 2 섬유로 정의합니다. 추가 분석을 위해 중간 2-4 섬유는 무시합니다(그림 1E).
   참고: 샘플의 4-6개 섬유 각각에 대해 다음 단계를 반복합니다. 글리코겐 부피 분획은 포인트 카운팅으로 추정됩니다. 그리드의 크기는 추정치의 만족스러운 높은 정밀도를 얻기 위해 선택됩니다. 이것은 종종 250개의 안타를 달성하여 얻을 수 있으며, 이는 필요한 총 점수 수와 점수당 면적을 결정합니다.
6. Segmented Line 도구를 사용하여 근골하 영역 바로 아래에서 볼 수 있는 가장 바깥쪽 근섬유의 길이를 측정합니다(그림 2A).
   메모: 이 길이는 표면적당 subsarcolemmal glycogen을 표현하는 데 사용됩니다(즉, 가장 바깥쪽 근섬유의 길이에 단면의 두께(60nm)를 곱한 값, 4.5단계 참조). 따라서 이 길이로 표시되는 사르콜레말하 영역만 분석에 포함됩니다.
7. Analyze > Tools > Grid를 클릭하여 그리드를 삽입하고 Area Per Point를 32,400 nm²로 설정합니다. 12개의 arcolemmal 이미지에서 사용 가능한 길이 내의 히트 수를 계산하며, 여기서 십자가는 subsarcolemmal glycogen에 부딪힙니다(그림 2A). 히트는 십자가의 오른쪽 상단 모서리에 존재하는 글리코겐 입자로 정의됩니다.
8. Analyze > Tools > Grid를 클릭하여 그리드를 삽입하고 Area Per Point 를 160,000 nm²로 설정합니다. 12개의 근섬유(myofibrillar) 이미지에서 십자가가 근섬유내 공간(myofibrillar space)에 부딪히는 히트 횟수를 계산합니다(그림 2B).
9. Analyze > Tools > Grid를 클릭하여 그리드를 삽입하고 Area Per Point를 3,600 nm2로 설정합니다. 12개의 근섬유(myofibrillar) 이미지에서 십자가가 근섬유내 글리코겐(intramyofibrillar glycogen)에 부딪히는 횟수를 세어봅니다(그림 2C).
10. Analyze > Tools > Grid를 클릭하여 그리드를 삽입하고 Area Per Point를 32,400 nm²로 설정합니다. 12개의 근섬유(myofibrillar) 이미지에서 십자가가 근섬유간글리코겐(intermyofibrillar glycogen)에 부딪히는 횟수를 세어봅니다(그림 2D).
11. Straight Line 도구를 사용하여 12개의 이미지 각각에 대해 각 풀에서 무작위로 선택된 5개의 글리코겐 입자의 직경을 측정하여 섬유당 풀당 평균 60개의 입자를 얻습니다.
    참고: 60개 입자의 평균은 대부분 섬유 내 변화를 포함합니다(그림 2F).

그림 1: 이미징 및 광섬유 타이핑.(A) 각 광섬유는 무작위 체계적 순서로 이미지화됩니다. (B) 사르콜레마하 공간(subsarcolemmal space)에서 촬영한 이미지의 예. (C) 근섬유공간(myofibrillar space)에서 가져온 이미지의 예. (D) 각 근섬유질 이미지에서 하나의 Z-디스크의 너비를 측정합니다(빨간색 선). 총 12개의 Z-디스크(이미지당 1개)를 측정하면 약 0.03의 오류 계수가 나타납니다. (E) 10개의 생검 각각에 대해 6-10개의 섬유에서 평균 섬유 Z-디스크 너비의 일반적인 분포. 각 생검에서 2-3개의 섬유는 생검 내 분포에 따라 유형 1과 2로 정의됩니다. 이 이미지는 이전 연구에 포함된 역도 선수의 m. vastus lateralis의 생검에서 비롯되었습니다. m: 미토콘드리아 및 Z: Z 디스크.

그림 2: 글리코겐 분석. (A) 표면적당 근골하 글리코겐 부피는 가장 바깥쪽 근섬유의 길이와 이 길이에 수직인 근골하 영역(파란색 점선)으로 정의된 영역 내에서 180nm x 180nm의 그리드 크기를 사용하여 점 계수로 추정됩니다. (B) 근섬유부피 분율은 400nm x 400nm의 그리드 크기를 사용하여 포인트 카운팅으로 추정됩니다. (C) intramyofibrillar glycogen의 부피 분율은 60 nm x 60 nm의 그리드 크기를 사용하여 포인트 카운팅으로 추정됩니다. (D) intermyofibrillar glycogen의 부피 분율은 180 nm x 180 nm의 그리드 크기를 사용하여 포인트 카운팅으로 추정됩니다. A-D에서 빨간색 원은 히트(글리코겐 입자에 부딪히는 십자가)를 나타냅니다. (E) 2 내지 12개의 분석된 이미지에 대한 입체비 추정치에 대한 추정 오차 계수. 오류 계수는 카운트 수를 기준으로 추정되므로 글리코겐 농도에 따라 샘플마다 다릅니다. 글리코겐 함량이 높을 때 상대적으로 낮은 경우가 많으며 그 반대의 경우도 마찬가지입니다. (F) 2-99 입자를 측정 한 후 글리코겐 입자 직경의 변동 계수.