Scanning Electron Microscopy를 사용한 멤브레인 러플 형성의 정량화

초록

출처: Ahn, W. et al., 주사 전자 현미경을 사용하여 멤브레인 러플 형성 시각화.J. Vis. 특급 (2021)

이 비디오는 주사 전자 현미경, SEM을 사용하여 멤브레인 주름을 표시하는 대식세포 세포의 샘플 준비, 고정 및 이미징을 보여줍니다. 멤브레인 형태 및 조직에 대한 자세한 정보는 세포의 생리학적 상태를 이해하는 데 매우 중요합니다.

프로토콜

1. 세포주 및 세포 배양

1. 37°C 및 5% CO₂의 가습 인큐베이터에서 10%(vol/vol) 열 비활성화 소 태아 혈청(FBS), 페니실린 100IU/mL 및 스트렙토마이신 100μg/mL가 보충된 Dulbecco의 DMEM(Modified Eagle Medium)에서 RAW 264.7 대식세포를 성장시킵니다. 성장 배지는 격일로 교체하십시오.
2. 세포가 80% 합류하면 멸균 PBS를 사용하여 플레이트를 두 번 세척합니다.
3. 1,000 μL의 0.5% 트립신-EDTA를 첨가하여 세포를 분리하고 37°C의 가습 배양기에서 3-5분 동안 세포 배양 플레이트를 배양합니다.
4. 세포 해리를 확인하기 위해 광학 현미경으로 플레이트를 검사합니다. 10% FBS를 함유한 성장 배지 10mL를 첨가하여 트립신을 비활성화합니다.
5. 50mL 코니컬 튜브에 세포 현탁액을 넣고 실온에서 5분 동안 400 x g의 속도로 원심분리합니다. 전체 세포 배양 배지에서 세포를 부드럽게 재현탁하고 Trypan Blue(0.4%) 염색을 사용하여 세포 수와 생존율을 측정합니다.
   메모: 이 실험에 권장되는 최소 세포 생존율은 >90%입니다.
6. 멸균 유리 커버슬립을 고압증기멸균 집게를 사용하여 24웰 플레이트의 웰에 놓습니다. 시드 세포를 1 x 10⁶ cells/mL의 밀도로 커버슬립에 삽입하고 37°C 및 5% CO₂의 가습 인큐베이터에서 밤새 플레이트를 배양합니다.
7. 처리 전에 새로운 500μL 완전 배지로 각 웰의 배지를 교체하십시오. 비히클(EIPA를 용해시키는 데 사용되는 DMSO 또는 기타 용매) 또는 마크로피노사이토시스 억제제 5-(N-에틸-N-이소프로필)-아밀로라이드(EIPA, 25 μM)로 대식세포를 30분 동안 전처리합니다.
세포를 막주름 형성
8. 을 촉진하기 위해 거대세포작용의 비히클 및 자극제로 세포를 치료: phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA, 1 μM, 30분) 및 대식세포 집락 자극 인자 (M-CSF, 100 ng/mL, 30 분).
   메모: 대식세포증가증의 대체 억제제[예: 라트룬쿨린 A(1μM, 30분) 또는 사이토칼라신 D(1μM, 30분)] 및 자극제[예: 표피 성장 인자(EGF, 100ng/mL, 10분) 또는 혈소판 유래 성장 인자(PDGF, 100ng/mL, 15분)]도 대식세포 및 기타 세포 유형에서 대세포구증가증을 특성화하는 데 사용할 수 있습니다. 세포는 거대세포작용(macropinocytosis)의 생리적 자극제로 치료하기 전에 하룻밤 동안 혈청을 굶주려야 할 수 있습니다. 가장 효과적인 농도와 배양 시간은 다른 세포 유형에서 거대세포작용(macropinocytosis)을 자극하기 위해 결정되어야 한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다.

2. SEM 고정

1. 처리 후 웰에서 매체를 흡입하고 얼음처럼 차가운 PBS로 커버슬립을 두 번 세척합니다.
2. 실온에서 30분 동안 세포(0.1M 카코딜산나트륨에 포함된 4% 파라포름알데히드 및 2% 글루타르알데히드)를 고정한 다음 4°C의 정착제에서 하룻밤 배양합니다.
3. 세포 단층을 방해하지 않고 다음 시약 500 μL로 커버슬립을 부드럽게 세척하고 배양합니다.
   1. 0.1 M 카코딜산 나트륨에 한 번 세척하고 15분 동안 배양합니다.
   2. dH₂O로 두 번 세척하고 각 세척에서 10분 배양합니다.
   3. 25% 에탄올로 두 번 세척하고 각 세척에서 10분 배양합니다.
   4. 50% 에탄올로 두 번 세척하고 각 세척에서 10분 배양합니다.
   5. 75% 에탄올로 두 번 세척하고 각 세척에서 10분 배양합니다.
   6. 80% 에탄올로 두 번 세척하고 각 세척에서 10분 배양합니다.
   7. 95% 에탄올로 두 번 세척하고 각 세척에서 10분 배양합니다.
   8. 100% 에탄올로 두 번 씻으십시오. 각 세척에서 10분의 배양을 수행합니다.
      메모: 시약의 교체/교체는 세포의 공기 건조를 방지하기 위해 빠르게 이루어져야 합니다. 커버슬립은 100% 에탄올에 4°C에서 며칠 동안 방치할 수 있습니다. 장기 보관을 위해 100% 에탄올을 추가로 첨가하고 파라필름으로 웰을 덮어 샘플의 공기 건조를 방지합니다.

3. 임계점 건조

1. Critical Point Dryer에 커버슬립을 넣고 100% 에탄올로 덮습니다. 전원 버튼을 누르고 CO₂ 탱크를 엽니다.
2. 온도가 30°C로 낮아질 때까지 냉각 버튼을 약 0초 동안 누릅니다. 챔버 창에 거품이 나타날 때까지 채우기 버튼을 누릅니다.
3. 퍼지 배기가스에서 에탄올 냄새가 사라질 때까지 퍼지 버튼을 누릅니다. 온도가 0 °C로 내려갈 때까지 냉각 버튼을 다시 누릅니다.
4. Fill 및 Purge 버튼을 눌러 전원을 끄고_{CO 2} 탱크를 닫습니다. Cool 버튼을 눌러 전원을 끄고 Heat 버튼을 누릅니다.
5. 온도를 42°C로, 압력을 1,200psi로 설정합니다. 압력과 온도가 안정되면 블리드 버튼을 눌러 압력이 천천히 감소하도록 합니다.
6. 챔버 압력이 150psi에 도달하면 환기 버튼을 누르고 압력이 0psi로 감소할 때까지 기다립니다. 임계점 건조기를 끄고 커버슬립을 제거합니다.
7. 탄소 접착 탭을 사용하여 SEM 알루미늄 시편 마운트에 커버슬립을 장착하고 스퍼터 코팅기에 금/팔라듐을 사용하여 스퍼터 코팅을 적용합니다.
8. 전원 버튼을 켜고 진공이 30mTorr에 도달할 때까지 기다립니다. 가스 스위치를 끄고 미세 가스 밸브를 시계 반대 방향으로 돌려 챔버를 세척하여 습기와 공기를 제거합니다.
9. 진공이 200mTorr로 증가하면 가스 스위치를 끄고 진공이 30mTorr에 도달할 때까지 기다립니다. 이 단계를 3회 반복합니다.
10. 타이머 버튼을 누르고 볼륨을 조정하십시오.tage 게이지가 10mA를 읽을 때까지 노브. 챔버에서 코팅된 커버슬립을 제거합니다.
    메모: 제조업체의 지침에 따라 샘플의 임계점 건조 및 스퍼터 코팅을 수행합니다.

4. 이미징 및 정량화

1. 샘플 커버슬립을 주사 전자 현미경의 챔버에 삽입합니다. 문을 닫고 대피 버튼을 누릅니다.
2. SEM 운영 소프트웨어를 엽니다. 가속 전압을 15kv로 설정하고 작동 거리를 10mm로 설정합니다.
3. 좌표 버튼을 누르고 셀이 관찰 화면 중앙에 나타날 때까지 컨트롤러 주위를 이동합니다. 배율을 3,500x로 설정하고 사진 버튼을 클릭하여 샘플을 이미지화합니다.
   메모: 더 높은 수준의 배율(8,500x - 16,000x)을 사용하여 원형질막을 더 자세히 표시합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.5% 트립신-EDTA	지브코	제15400-054
2% 글루타르알데히드	전자 현미경 과학	16320
파라포름알데히드 4%	산타 크루즈 생명 공학	281692
5- (N- 에틸 -N- 이소 프로필) - 아밀로 라이드	시그마 생명과학	A3085
탄소 접착 탭	전자 현미경 과학	제77825-09
디메틸 설폭 사이드	코 닝	25-950-CQC
둘베코의 변형된 독수리 매체	싸이티바 생명과학	SH30022.01
Falcon 24웰 투명 평면 바닥 TC 처리된 멀티웰 세포 배양 플레이트	송골매	353047
소 태아 세럼	제미니 바이오	900-108
HERAcell 150i CO2 인큐베이터	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	51026282
허머 모델 6.2 스퍼터 코터	아나텍 미국	58565
JSM-IT500HR 주사 전자 현미경
현미경 커버 유리	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	제12-545-82
펜 스트렙	지브코	15140-122
Phorbol 12- 미리 스테이트 13- 아세테이트	밀리포어 시그마	524400
RAW 264.7 대식세포	증권 시세	ATCC TIB-71
재조합 인간 M-CSF	페프로텍	300-25
Samdri-790 임계점 건조기	투시미스 리서치 코퍼레이션	8778B
SEM 알루미늄 시편 마운트	전자 현미경 과학	75220
소듐 카코딜레이트	전자 현미경 과학	12,300
Trypan 블루 솔루션	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	15250061

호 년 호 년 ) 년 ) 호 년 표시기 년 년 년 )