Scanning Electron Microscopy를 사용한 멤브레인 러플 형성의 정량화

Abstract

출처: Ahn, W. et al., 주사 전자 현미경을 사용하여 멤브레인 러플 형성 시각화.J. Vis. 특급 (2021)

이 비디오는 주사 전자 현미경, SEM을 사용하여 멤브레인 주름을 표시하는 대식세포 세포의 샘플 준비, 고정 및 이미징을 보여줍니다. 멤브레인 형태 및 조직에 대한 자세한 정보는 세포의 생리학적 상태를 이해하는 데 매우 중요합니다.

Protocol

1. 세포주 및 세포 배양

1. 37°C 및 5% CO₂의 가습 인큐베이터에서 10%(vol/vol) 열 비활성화 소 태아 혈청(FBS), 페니실린 100IU/mL 및 스트렙토마이신 100μg/mL가 보충된 Dulbecco의 DMEM(Modified Eagle Medium)에서 RAW 264.7 대식세포를 성장시킵니다. 성장 배지는 격일로 교체하십시오.
2. 세포가 80% 합류하면 멸균 PBS를 사용하여 플레이트를 두 번 세척합니다.
3. 1,000 μL의 0.5% 트립신-EDTA를 첨가하여 세포를 분리하고 37°C의 가습 배양기에서 3-5분 동안 세포 배양 플레이트를 배양합니다.
4. 세포 해리를 확인하기 위해 광학 현미경으로 플레이트를 검사합니다. 10% FBS를 함유한 성장 배지 10mL를 첨가하여 트립신을 비활성화합니다.
5. 50mL 코니컬 튜브에 세포 현탁액을 넣고 실온에서 5분 동안 400 x g의 속도로 원심분리합니다. 전체 세포 배양 배지에서 세포를 부드럽게 재현탁하고 Trypan Blue(0.4%) 염색을 사용하여 세포 수와 생존율을 측정합니다.
   메모: 이 실험에 권장되는 최소 세포 생존율은 >90%입....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% 트립신-EDTA	지브코	제15400-054
2% 글루타르알데히드	전자 현미경 과학	16320
파라포름알데히드 4%	산타 크루즈 생명 공학	281692
5- (N- 에틸 -N- 이소 프로필) - 아밀로 라이드	시그마 생명과학	A3085
탄소 접착 탭	전자 현미경 과학	제77825-09
디메틸 설폭 사이드	코 닝	25-950-CQC
둘베코의 변형된 독수리 매체	싸이티바 생명과학	SH30022.01
Falcon 24웰 투명 평면 바닥 TC 처리된 멀티웰 세포 배양 플레이트	송골매	353047
소 태아 세럼	제미니 바이오	900-108
HERAcell 150i CO2 인큐베이터	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	51026282
허머 모델 6.2 스퍼터 코터	아나텍 미국	58565
JSM-IT500HR 주사 전자 현미경
현미경 커버 유리	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	제12-545-82
펜 스트렙	지브코	15140-122
Phorbol 12- 미리 스테이트 13- 아세테이트	밀리포어 시그마	524400
RAW 264.7 대식세포	증권 시세	ATCC TIB-71
재조합 인간 M-CSF	페프로텍	300-25
Samdri-790 임계점 건조기	투시미스 리서치 코퍼레이션	8778B
SEM 알루미늄 시편 마운트	전자 현미경 과학	75220
소듐 카코딜레이트	전자 현미경 과학	12,300
Trypan 블루 솔루션	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	15250061