미세혈관 혈전 형성을 연구하기 위한 Intravital Fluorescence Microscopy

초록

출처: Strüder, D., et al. 털이 없는 쥐의 귓불에서 생체 내 현미경 검사 및 혈전 유도. J. Vis. 특급. (2017년)

이 비디오는 마우스 모델에서 혈전 형성을 연구하기 위한 생체 내 형광 현미경 검사 기술을 보여줍니다. 마우스는 혈액 순환을 모니터링하기 위해 형광단이 표지된 다당류를 주입합니다. 고강도의 빛으로 조명을 비추면 귀의 미세 혈관 구조에서 손상의 광독성 유도가 혈전을 형성하게 되며, 이는 혈류의 방해를 시각화하여 확인됩니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 동물의 사전 배치

1. 마우스의 무게를 측정하고 각 약물(예: 카나비노이드, 체중 5mg/kg(bw))을 인슐린 주사기에 로드합니다. 혈전 유도 30분 전에 약물을 투여하십시오.
2. 엄지와 검지 사이에 마우스의 목을 잡고 새끼 손가락으로 마우스의 꼬리를 잡고 동물을 스트레칭하고 복부의 왼쪽 하단 사분면에 복강내(ip)로 약물을 주입합니다. 동물을 15분 동안 우리에 다시 넣습니다.
3. 케타민(90mg/kg bw)과 자일라진(25mg/kg bw)으로 마취를 준비합니다.혈전 유도 15분 전에 마우스를 마취합니다. 마우스를 케이지에 넣고 꼬리를 약간 당긴 다음 인슐린 주사기로 마취제 IP를 주입합니다.
4. 마취가 시작될 때까지 마우스를 케이지에 다시 넣습니다. 충분한 마취를 확인하려면 집게로 꼬리를 꼬집습니다.
5. 0.05mL의 해동된 플루오레세인 이소티오시아네이트 표지 덱스트란(FITC-dextran; 5%, 150kDa)을 인슐린 주사기에 로드합니다. 주사기를 채우는 동안 기포가 남아 있지 않은지 확인하십시오., 정맥 주사(iv)로 투여되는 작은 기포도 동물에게 치명적일 수 있습니다.
6. 마취된 마우스를 앞면이 아래로 향하게 한 상태로 가열판에 놓습니다. 가열판을 37°C로 조정합니다.
7. 마우스의 각막에 안연고를 바르십시오. 피부를 소독하고 멸균 기구를 사용하십시오.
8. 폴리프로필렌 7/0 봉합사 두 개를 오른쪽 귀의 두개골과 꼬리 가장자리에 꿰매십시오. 스티치를 가장자리에 최대한 가깝고 바닥과 최대한 근접하게 놓습니다(그림 1B).
9. 마우스를 등쪽 위치로 이동합니다. 접착 스트립을 사용하여 모든 다리를 아크릴 유리 플랫폼에 고정합니다. 앞니 아래에 봉합사를 걸고 접착 스트립으로 아크릴 유리에 봉합사를 붙여 머리를 배측 굴곡 상태로 배치합니다.
10. 수술 실체 현미경 아래 플랫폼에 동물을 이동시킵니다. 16X 배율을 사용합니다.

2. 좌측 경정맥 준비 및 FITC-덱스트란 주사

참고: 오른쪽 귀 현미경 검사를 위해 왼쪽 경정맥을 준비하십시오.

1. 메스를 사용하여 목 왼쪽 피부를 두개골 꼬리 방향으로 5mm 절개합니다. 마이크로핀셋과 마이크로가위로 피하 조직을 절개합니다. 교차로를 폴리에스테르 8/0 봉합사 또는 전기 응고제로 접합하십시오.
2. 혈관을 건드리지 않고 마이크로 집게와 마이크로 가위를 사용하여 정맥을 외막에서 자유롭게 합니다.
3. 형광 염료 주입을 위해 준비된 인슐린 주사기를 사용하십시오. 정맥을 천공하지 않고 마이크로 집게로 혈관 벽을 조심스럽게 잡습니다. 팽창된 혈관 벽을 주사기로 관통하고 FITC-dextran iv를 주입합니다.
4. 주사기를 빼낸 후 면봉을 사용하여 출혈을 멈춥니다. 귀의 혈액 및 염료 오염을 피하십시오.

3. 생체 내 형광 현미경 검사를 위한 오른쪽 귀 위치

1. 가열판에 있는 동물을 가열판용 슬롯과 귀 위치를 위한 0.5cm 높이의 평면이 있는 아크릴 유리 구조로 옮깁니다.
2. 접착 스트립을 사용하여 동물을 가열판에 뒤집어 고정합니다. 귀 기저부의 비교적 강하고 볼록한 연골을 0.5cm 높이의 귀면 옆(그림 1B) 옆에 놓아 귀의 정점 부분이 평면에 평평하게 위치할 수 있도록 합니다.
3. 귀를 배치하기 위해 아크릴 유리 평면에 실온 0.9% NaCl 한 방울을 떨어뜨립니다. 오목한 복부 쪽의 미리 준비된 봉합사가 아래를 향하도록 하여 0.9% NaCl을 떨어뜨리십시오. 면봉을 사용하여 NaCl 방울을 흡수하고 모세관 힘이 귀 평면을 아크릴 유리에 부착하도록 합니다.
4. 귀의 위치를 고정하기 위해 아크릴 유리에 봉합사를 테이프로 붙입니다.
5. 0.9% 실온 NaCl을 귀의 볼록한 등쪽에 한 방울 떨어뜨립니다. 귀로 들어가는 기저혈관을 압박하지 않고 커버슬립 하나(직경 0.5cm)를 귀에 조심스럽게 끼웁니다. 면봉을 사용하여 커버슬립 아래에서 가능한 한 많은 NaCl을 제거하여 커버슬립과 귀 대상 혈관 사이의 거리를 최소화합니다.

4. 오른쪽 귀의 생체 내 형광 현미경 검사 및 혈전 유도

1. FITC-dextran 시각화를 위해 생체 내 형광 현미경을 조정합니다(450 - 490nm; FT: 510; LP: 520). 가변 100W 수은 램프를 광원으로 사용합니다. 고해상도 흑백 CCD 카메라를 DVD 레코더에 연결합니다.
2. 외전귀가 고정된 가열판이 들어 있는 아크릴 유리에 동물을 이식하여 생체 내 형광 현미경의 책상으로 옮깁니다.
3. 20X 배율(20X/0.95 숫자 조리개)과 20% 광도를 사용하여 직경이 50 - 60 μm이고 전행성 혈류가 400 - 600 μm/s인 정맥관을 검색합니다.
4. 커버슬립에 실온의 물 한 방울을 떨어뜨려 63x 배율 대물렌즈(63X/0.95 숫자 조리개)를 물에 담글 수 있습니다. 직경 1mm의 캐뉼라가 있는 주사기를 사용하여 현미경의 대물렌즈에 방울을 놓습니다. 커버슬립과 대물렌즈에 물방울이 닿을 만큼만 물을 추가합니다.
5. 물방울을 뿌린 직후, 직경과 혈류의 오프라인 측정을 위해 20% 광도로 20초 동안 혈관을 기록하기 시작합니다.
6. FITC-덱스트란 주사 5분 후 혈전 유도를 시작합니다. 이를 위해 광도를 100%로 높입니다.
7. 혈전 유도 중에는 30초 이내에 현미경의 조리개를 2초 동안 닫아 혈류를 확인합니다. 혈류가 지속되면 조리개를 다시 엽니다. 혈류가 멈춘 경우 30초 동안 혈관을 관찰하십시오.
   메모: 혈관은 흐름이 30초 이상 정지하거나 혈액이 역행하는 경우 폐색으로 분류됩니다. orthograde 혈류가 다시 시작되면 조리개를 완전히 열고 위에서 설명한 대로 혈관 폐색이 발생할 때까지 혈전 유도를 계속합니다. 초기 혈전 유도 중에는 거의 연속적인 에피 조명을 유지하기 위해 혈류를 확인하기 위해 조리개를 닫은 시간을 가능한 한 짧게 유지하십시오. 나중에, 혈전이 성장하는 동안, 혈관은 형광 염료가 덜 함유되어 관류되어 지속적으로 관찰될 수 있습니다.
8. 귀당 5개의 혈관을 선택하고 폐색합니다. 현미경으로 혈전이 유도되는 시간을 FITC-dextran 주입 후 약 1시간으로 제한합니다.

결과

그림 1. 경정맥 준비(A) 및 생체 내 현미경 검사를 위한 귀 배치(B). (A) 수술 실체현미경을 사용하여 오른쪽 경정맥을 준비합니다. 왼쪽 귀 배치를 위한 봉합사는 FITC-덱스트란을 주입하기 전에 꿰매어집니다. 이전에 왼쪽 경정맥을 절개하여 생긴 상처는 경피적 봉합사(B)로 봉합합니다. 왼쪽 귀는 폴리프로필렌 7/0 봉합사로 고정되어 있습니다. 커버슬립은 귀의 기저혈관을 압박하지 않고 조심스럽게 놓습니다. 가열판은 전체 실험 동안 동물의 체온을 유지합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
SKH-1/hr 마우스	찰스 리버	477	다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다.
작동 실체 현미경	라이카	M651/M655	다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다.
생체 내 현미경	자이스	액시오텍 바리오 100	다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다.
목표(20x/0.95)	자이스	20배/0,50W; 플랜-네오플루아르	다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다.
객관적(63x/0.95)	자이스	63배/0,95W; 아크로플랜	다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다.
흑백 CCD 카메라	파이퍼	FK 6990 IQ-S	다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다.
DVD 레코더	파나소닉	DMR-EX99V	다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다.
소금	브라운	1011년 5월 12612055일	다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다.
케타민 10%	벨라 팜	F3901-6	다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다.
자일라진 2%	바이엘	6293841.00.00	다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다.
FITC-덱스트란 5%	시그마	46945-100MG-F	다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다.
덱사판테놀 5% 아이 연고	바이엘	6029009.00.00	다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다.
디엠소	시그마	472301	다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다.
커버 슬립 5 x 5 x 1mm	멘젤	L4339	다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다.
고약	류코실크	4683400	다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다.
면봉	산요	604-A-1	다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다.
적외선	뵈러	5/13855	다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다.
일회용 주사기	브라운	2020-08	다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다.
인슐린 주사기	브라운	9161502	다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다.
일회용 피하 주사 바늘	브라운	전화: 465 7640	다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다.
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메스 21	달하우젠	11.000.00.511	다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다.
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