방법 논문

DNA Double-Strand Break 분석을 위한 면역형광 현미경 검사

2025년 7월 8일

이 논문에서

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

출처: Popp, H. D., et al. DNA 이중 가닥 절단의 형성 및 복구를 분석하기 위한 γH2AX 및 53BP1의 면역형광 현미경. J. Vis. 특급 (2017년)

이 비디오에서는 인간 단핵 세포의 DNA 이중 가닥 절단 부위에 국한된 특정 DNA 손상 반응 단백질을 검출하는 면역형광 현미경 검사 기술에 대해 설명합니다. 단백질은 특정 1차 항체에 의해 인식되며, 이 항체는 다시 현미경 시각화 중에 형광을 발하는 형광단 표지된 2차 항체에 결합하여 단백질을 세포핵 내에서 뚜렷한 형광 병소로 시각화할 수 있습니다.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

인간 참가자와 관련된 모든 절차는 인간 복지를 위한 제도적, 국가적, 국제적 지침에 따라 수행되었으며 지역 기관 검토 위원회의 검토를 거쳤습니다.

1. 사이토스핀의 준비

  1. 환자 샘플의 단핵 세포가 있는 2개의 사이토스핀(즉, γH2AX 면역형광 염색을 위한 1개의 사이토스핀과 γH2AX 및 53BP1 결합 면역형광 염색을 위한 1개의 사이토스핀)을 각 제제에 대해 1.0 x 10 5 세포의 원심분리(300 x g, 10분)로 준비합니다(그림 1 및 2).

2. γH2AX 및 53BP1 면역형광 염색

  1. 고정 및 투과성: 200μL의 4% PFA로 세포를 10분 동안 고정합니다. 고정 후 실험실 셰이커에서 30mL의 PBS로 각각 5분씩 세포를 부드럽게 3회 세척합니다. 그런 다음 200μL의 0.1% Octoxinol 9로 10분 동안 세포를 투과시킵니다. 실험실 셰이커에서 30mL의 5% 차단 용액으로 각각 5분씩 세포를 부드럽게 세 번 세척합니다. 30mL의 신선한 5% 차단 용액으로 세포를 1시간 동안 차단합니다.
  2. 항체를 이용한 배양
    1. 한 가지 세포 제제는 마우스 단클론 항-γH2AX 항체(1:500)로 배양하고, 다른 한 가지 세포는 마우스 단클론 항-γH2AX 항체(1:500) 및 다클론 토끼 항-53BP1 항체(1:500)로 4°C에서 밤새 배양합니다.
    2. 배양 후 실험실 셰이커에서 5분마다 30mL의 2% 차단 용액으로 세포를 부드럽게 3회 세척합니다.
    3. 차단용액을 제거하고 1차 세포에 Alexa488 복합 염소 항마우스 2차 항체(1:500)를 주입하고, 2차 세포에 Alexa488 접합 염소 항마우스 2차 항체(1:500) 및 Alexa555 복합 당나귀 항토끼 2차 항체(1:500)를 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
  3. 장착 매체: 세포가 있는 슬라이드를 그릇에 넣고 실험실 셰이커에서 5분마다 30mL의 PBS로 세포를 부드럽게 세 번 세척합니다. PBS를 제거하고 4,6-디아미디노-2-페닐린돌을 함유한 장착 매체로 셀을 장착합니다. 기포가 끼지 않도록 장착 매체 위에 커버 슬립을 조심스럽게 놓습니다. 형광 현미경 검사로 세포를 분석하기 전에 장착 매체가 경화될 때까지 최소 3시간 동안 기다리십시오.

3. γH2AX 및 53BP1 병소 분석

  1. 형광 현미경: 100X 대물렌즈 배율에서 이미징하는 동안 DAPI, Alexa 488 및 Cy3용 필터가 장착된 형광 현미경으로 세포핵의 γH2AX 및 53BP1 병소를 분석합니다. 카메라로 이미지를 기록하고 적절한 이미징 소프트웨어로 이미지를 처리합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
그림 1 : 사이토스핀을 준비하기 위한 장치.

figure-results-2
그림 2 : 사이토스핀의 제조. 각 샘플의 2개의 사이토스핀을 300 x g에서 1.0 x 105개 세포의 원심분리로 10분 동안 준비합니다. 하나의 cytospin은 γH2AX 면역형광 염색에 사용되고, 다른 cytospin은 γH2AX와 53BP1 면역형광 염색을 결합하는 데 사용됩니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
선언된 이해 상충이 없습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
진단용 현미경 슬라이드써모 사이언티픽(Thermo ScientificER-203B-CE24현미경 슬라이드
메가 퍼지 1.0 R헤레우스75003060탁상용 원심분리기
사이토스핀 장치
뚜껑헤레우스76003422마이크로 튜브 없이 작업하기 위한 뚜껑
사이토 컨테이너헤레우스750034162개의 원뿔형 구멍이 있는 사이토 용기
클립 캐리어헤레우스75003414cyto container와 slide를 고정하기 위한 Carrier
인서트 지원헤레우스75003417클립 캐리어를 고정하기 위한 지지대 인서트
파라포름알데히드시그마-알드리치P6148정착제
인산염 완충 식염수시그마-알드리치D8537균형 잡힌 소금 용액
화학차단제머크 밀리포어2170차단제
마우스 단클론 항-γH2AX 항체 (JBW301)머크 밀리포어제05-636γH2AX 검출을 위한 1차 항체
다클론 토끼 항-53BP1 항체 (NB100-304)Novus 생물학적 제제NB100-30453BP1 검출을 위한 1차 항체
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse 항체인비트로젠A-110012차 항체
Alexa Fluor 555-conjugated donkey anti-rabbit 항체인비트로젠A-31572 2차 항체
Vectashield 장착 매체벡터 연구소H-1200DNA 염색을 위한 DAPI 함유
악시오 스코프.A1자이스490035형광 현미경
쿨 큐브 1 CCD 카메라메타시스템H-0310-010-MS디지털 녹화를 위한 카메라 시스템
아이시스 소프트웨어메타시스템해당 없음현미경 소프트웨어
) (영문) 년 호 (영어)

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

Gamma H2AX53BP112DAPI

관련 논문