$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. 15N, 13C-Tau 생산 (그림 1)
- ATransform pET15b-Tau BL21(DE3) 수용 대장균 박테리아 세포로 재조합 T7 발현 플라스미드.
참고: 가장 긴(441개의 아미노산 잔기) Tau isoform에 대한 cDNA 코딩은 pET15b 플라스미드의 NcoI 및 XhoI 제한 부위 사이에서 복제됩니다.
- 1.5ml 플라스틱 튜브에 100ng의 플라스미드 DNA와 함께 플라스미드 DNA μg당 1-5 x 107 콜로니를 형성하는 50μl의 유능한 BL21(DE3) 세포를 부드럽게 혼합합니다.
메모: 진핵생물 cDNA 발현을 위해 코돈 사용에 최적화된 박테리아 균주는 human Tau를 생산하는 데 필수적인 것은 아닙니다.
- 세포 혼합물을 얼음 위에 30분 동안 놓고 42°C에서 10초 동안 열 충격을 가합니다. 튜브를 다시 얼음 위에 5분 동안 놓고 실온 LB(Luria-Bertani) 배지 1ml를 추가합니다. 박테리아 현탁액을 37°C에서 30분 동안 부드럽게 교반하면서 배양합니다.
- 접종 루프를 사용하여 100μl의 세포 현탁액을 100μg/ml의 암피실린 항생제가 함유된 LB 배지의 한천 플레이트에 고르게 펴 바릅니다.
- 선택 플레이트를 37 ° C에서 15 시간 동안 배양합니다.
- 배양 단계가 진행될 때까지 선택 플레이트를 약 4주 동안 약 2°C로 유지합니다.
참고: -80°C에서 보관된 박테리아 배양액(50% 글리세롤)의 글리세롤 스톡을 준비하여 나중에 배양을 시작할 수 있습니다.
- 1 ml 1 M MgSO4, 1 ml 100 mM CaCl2, 10 ml 100x MEM 비타민 보체, 1 ml 100 mg/ml 암피실린을 1 L의 오토클레이브 M9 염 (6 g Na2HPO4, 3 g KH2PO4, 0.5 g NaCl)에 첨가합니다.
메모: 빠르게 소멸되는 M9 염에 CaCl2 용액을 첨가하면 흰색 침전물이 형성됩니다.
- M9 배지 10ml에 15N, 13C-complete 배지 300 mg, 15NH4Cl 1 g 및 13C6-글루코스 2 g을 용해시킵니다. 0.2μm 필터를 사용하여 동위원소 용액을 M9 매체에 직접 필터 멸균합니다.
- 100μg/ml의 암피실린이 보충된 20ml의 LB 배지에 있는 선택 플레이트에서 pET15b-Tau 형질전환균의 한 콜로니를 접종 루프를 사용하여 현탁시킵니다.
- 접종된 배지를 37°C에서 약 6시간 동안 배양합니다.
- 플라스틱 분광계 cuvette.
에서 박테리아 배양을 10배 희석한 1ml에서 600nm(OD600)에서 광학 밀도를 측정합니다.
메모: 3.0-4.0의 OD600에 해당하는 박테리아 배양의 탁도는 포화 성장 단계에 도달했음을 나타냅니다.
- 2L Erlenmeyer 플라스틱 배플 배양 플라스크에 암피실린(100μg/ml 최종 농도)이 보충된 M9 성장 배지 1L에 포화 LB 배양 20ml를 추가합니다.
- 배양 플라스크를 10°C 및 50rpm으로 설정된 프로그래밍 가능한 인큐베이터에 넣습니다. 다음 날 이른 아침에 인큐베이터가 200RPM 및 37°C로 전환되도록 프로그래밍합니다.
- 플라스틱 분광계 큐벳에서 1ml의 박테리아 배양액에 대해 OD600을 측정합니다. OD600이 약 1.0의 값에 도달하면 400μl의 1M IPTG(이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드) 원액(-20°C에서 유지)을 추가하여 재조합 타우 단백질의 발현을 유도합니다.
- 37°C에서 3시간 더 배양을 계속합니다. 20분 동안 5,000 x g에서 원심분리를 통해 박테리아 세포를 수집합니다.
- 박테리아 펠릿을 -20 °C에서 동결합니다. 필요한 경우 장기간 동안 정제 단계까지 냉동 상태로 유지하십시오.
2. 15N, 13C-Tau의 정제 (그림 2)
- 오토클레이브 양이온 교환(CEX) 정제 버퍼는 121°C에서 15psi에서 20분 동안 버퍼를 4°C에서 보관합니다.
- 박테리아 세포 펠릿을 해동하고 프로테아제 억제제 칵테일 1x(1정) 및 DNAseI(2,000단위)를 갓 보충한 추출 CEX A 완충액(50mM NaPi 완충액, pH 6.5, 1mM EDTA) 45ml에 완전히 재현탁합니다.
- 20,000psi에서 고압 균질기를 사용하여 박테리아 세포를 파괴합니다. 3-4번의 패스가 필요합니다. 20,000 x g에서 40분 동안 원심분리기를 사용하여 불용성 물질을 제거합니다.
- 수조를 사용하여 박테리아 세포 추출물을 75°C에서 15분 동안 가열합니다.
참고: 몇 분 후에 흰색 침전물이 관찰됩니다.
- 15,000 x g에서 20분 동안 원심분리하고 열에 안정적인 Tau 단백질이 포함된 상층액을 유지합니다.
- 필요한 경우 다음 정화 단계까지 -20 °C에서 보관하십시오.
- 고속 단백질 액체 크로마토그래피(FPLC) 시스템을 사용하여 5ml 베드 컬럼으로 패킹된 강력한 CEX 수지에서 양이온 교환 크로마토그래피를 수행합니다(그림 3 A).
- 유속을 2.5ml/min으로 설정합니다.
- CEX A 버퍼의 열 평형
- Tau가 포함된 60-70ml의 가열된 추출물을 시료 펌프를 사용하거나 시스템에 따라 펌프 A를 사용하여 로드합니다. 분석을 위해 플로우 스루를 수집하여 Tau 단백질이 수지에 효율적으로 결합하는지 확인합니다(2.8 참조).
- 280nm에서의 흡광도가 기준선 값으로 돌아올 때까지 CEX A 버퍼로 수지를 세척합니다.
- CEX B 완충액(1M NaCl을 가진 CEX A 완충액)의 점진적인 증가로 얻은 3단계 NaCl 그래디언트를 사용하여 컬럼에서 Tau를 용리합니다. FPLC를 다음과 같이 프로그래밍합니다: 10개 컬럼 부피(CV)에서 25% CEX B 완충액으로 그래디언트의 첫 번째 단계는 250mM NaCl에 도달하고, 두 번째 단계는 500mM NaCl에 도달하기 위해 50% CEX B 완충액으로, 두 번째 단계는 2CV에서 100% CEX B 완충액으로 1M NaCl에 도달합니다. 용리 단계에서 1.5ml 분획을 수집합니다.
- SDS-PAGE(12% SDS-아크릴아미드 겔) 및 Coomassie 염색에 의해 용리 단계에서 수집된 분획 10μl를 분석합니다(그림 3 A). 10μl의 관류(flow-through)를 분석하여 컬럼의 로딩 단계도 확인합니다.
- Tau를 포함하는 분수를 선택하고 다음 단계를 위해 이러한 분수를 합칩니다.
- Tau 함유 풀링된 분획에 대해 완충액 교환을 수행합니다(그림 3 B).
- FPLC 시스템을 사용하여 50mM 중탄산암모늄(휘발성 완충액)에서 53ml G25 수지 패킹 베드(26 x 10cm)의 탈염 컬럼을 평형
화합니다.
- 유속을 5ml/min으로 설정합니다. 5ml 주입 루프를 통해 컬럼에 Tau 샘플을 주입합니다. 280nm에서 흡수 피크에 해당하는 분획을 수집합니다.
- 초기 CEX 풀의 볼륨에 따라 주입을 3-4회 반복합니다.
- 280nm에서 크로마토그램의 피크 면적을 사용하여 정제된 Tau 단백질의 양을 계산합니다(Tau 1mg은 140mAU*ml에 해당).
메모: 280 nm에서 타우 단백질의 흡광 계수는 7,550 M-1 cm-1입니다. 타우에는 Trp 잔류물이 포함되어 있지 않습니다.
- 모든 타우 분수를 풀링합니다.
- 1 - 5 mg의 Tau에 해당하는 튜브에 샘플을 분취합니다. 용액의 부피가 튜브의 부피에 비해 작도록 이 튜브를 선택하십시오(예: 50ml 튜브에 5ml의 용액).
- 바늘을 사용하여 튜브 캡에 구멍을 뚫습니다. 타우 샘플을 -80°C에서 동결합니다.
- 동결건조 타우 샘플. 동결건조된 타우 단백질은 -20°C에서 장기간 보관할 수 있습니다.
3. 15N-Tau의 체외 인산화
- 500μl 인산화 완충액(50mM Hepes·KOH, pH 8.0, 12.5mM MgCl2, 1mM EDTA, 50mM NaCl)에 동결건조된 Tau 5mg을 용해합니다.
- 2.5mM ATP(-20°C에서 유지되는 100mM 스톡 용액 25μl), 1mM DTT(-20°C에서 유지되는 1M 스톡 용액 1μl), 1mM EGTA(0.5M 스톡 용액 2μl), 1x 프로테아제 억제제 칵테일(1ml 인산화 완충액에 1정을 1정씩 용해시켜 얻은 40x 스톡 25μl) 및 1μM 활성화 His-ERK2(250μl)를 추가합니다. 보존 완충액 10mM Hepes, pH 7.3, 1mM DTT, 5mM MgCl2, 100mM NaCl 및 10% 글리세롤, -80°C에서 보관) 총 1ml.
메모: 활성화된 His-ERK2는 MEK kinase를 사용한 인산화를 통해 사내에서 준비할 수 있습니다.
- 37 °C에서 3 시간 배양합니다.
- 샘플을 75°C에서 15분 동안 가열하여 ERK 키나아제를 비활성화합니다.
- 20,000 x g에서 15분 동안 원심분리기 상층액을 수집하고 보관합니다.
- 1ml 샘플에 적합한 3.45ml G25 수지 패킹 베드(1.3 x 2.6cm) 컬럼을 사용하여 단백질 샘플을 50mM 중탄산
암모늄으로 탈염합니다.
- 단백질 샘플 2.5μl로 12% SDS-PAGE를 실행하여 무결성과 효율적인 인산화를 모두 확인합니다(그림 4).
- 인산화된 Tau 샘플을 동결건조합니다. 분말은 -20 °C에서 보관하십시오.
4. NMR 스펙트럼 획득(그림 5)
- 400 μl NMR 완충액 (50 mM NaPi 또는 50 mM 중수소화 Tris-d11)에서 동결 건조 된 15N, 13C ERK-인산화 -Tau 4 mg을 용해합니다. Cl, pH 6.5, 30mM NaCl, 2.5mM EDTA 및 1mM DTT)를 참조하십시오.
- NMR 분광계의 필드 잠금을 위해 5%D2O를 추가하고 내부 NMR 신호 참조로 1mM TMSP(3-(트리메틸실릴)프로피온-2,2,3,3-d4산성 나트륨 염))을 추가합니다. 완전한 프로테아제 억제제 칵테일의 40x 스톡 용액 10μl를 추가합니다.
- 긴 바늘 또는 파스퇴르 피펫이 있는 전자 주사기를 사용하여 샘플을 5mm NMR 튜브로 옮깁니다. 플런저를 사용하여 NMR 튜브를 닫습니다. 플런저의 움직임으로 플런저와 액체 사이에 갇힌 기포를 제거합니다.
- NMR 튜브를 스피너에 놓습니다. 사용된 NMR 프로브 헤드에 적합한 게이지를 사용하여 스피너의 수직 위치를 조정하여 대부분의 샘플 솔루션이 NMR 코일 내부에 있도록 합니다.
- 공기 흐름 시작: 자석 제어 시스템 창에서 리프트를 클릭합니다. 튜브가 있는 스피너를 자석 구멍 상단의 공기 흐름에 조심스럽게 놓습니다. 공기 흐름을 중지하고(딸깍 소리, 리프트) 튜브가 자석의 프로브 헤드 내부 제자리로 내려가도록 합니다.
- 온도를 25°C(298K)로 설정합니다.
- 프로브 헤드의 반자동 튜닝 및 매칭을 수행하여 동력 전달을 최적화합니다. 명령줄에 atmm을 입력합니다.
- 중수소 채널에 기록 된 샘플의 D2O 신호를 사용하여 분광계 주파수를 잠급니다. 자석 제어 시스템 창에서 잠금을 클릭합니다.
- 샘플 위치에서 자기장의 균질성을 최적화하기 위해 shimming 절차를 시작합니다. 명령줄에 topshim gui를 입력하여 shim 창을 엽니다. shim 창에서 시작을 클릭합니다. 잔차 B0 표준 변동 값을 확인하여 shim이 최적인지 확인합니다(2Hz 미만이 양호함).
- p1 매개변수(양성자 무선 주파수 펄스의 길이(μsec 단위))를 보정하며, 이는 양성자 스핀의 90° 회전을 얻는 데 필요합니다. 물 양성자의 1D 스펙트럼을 사용하여 360° 펄스를 조준합니다(그림 6).
- o1 매개변수(Hz)를 1D 스펙트럼의 양성자 수분 주파수로 설정하여 주파수 오프셋을 조정합니다(그림 6).
- 1D 양성자 스펙트럼(물 신호 억제를 위한 워터게이트 시퀀스가 있는 펄스 시퀀스, 예: zggpw5) 수집을 시작하여 샘플의 신호를 확인합니다(그림 7). 상대적인 단백질 농도에 맞게 스캔 횟수를 조정합니다. 명령줄에 zg를 입력하여 획득을 시작합니다.
