출처: Danis, C. et. al., 본질적으로 무질서한 단백질의 다중 인산화 식별을 위한 핵 자기 공명 분광법.J. Vis. 특급(2016).
이 비디오는 핵 자기 공명 분광법(NMR) 기술을 사용하여 단백질에서 여러 인산화를 식별하는 방법을 보여줍니다. 특정 아미노산에서 단백질의 인산화는 이웃 아미드 수소의 차폐 해제를 유발하여 스펙트럼 차이를 생성합니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
방법 논문
단백질에서 다중 인산화를 식별하기 위한 핵 자기 공명 분광법(Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy)
1.2K 조회수
⸱
2025년 7월 8일
이 논문에서
초록
프로토콜
1. 15N, 13C-Tau 생산 (그림 1)
- ATransform pET15b-Tau BL21(DE3) 수용 대장균 박테리아 세포로 재조합 T7 발현 플라스미드.
참고: 가장 긴(441개의 아미노산 잔기) Tau isoform에 대한 cDNA 코딩은 pET15b 플라스미드의 NcoI 및 XhoI 제한 부위 사이에서 복제됩니다.- 1.5ml 플라스틱 튜브에 100ng의 플라스미드 DNA와 함께 플라스미드 DNA μg당 1-5 x 107 콜로니를 형성하는 50μl의 유능한 BL21(DE3) 세포를 부드럽게 혼합합니다.
메모: 진핵생물 cDNA 발현을 위해 코돈 사용에 최적화된 박테리아 균주는 human Tau를 생산하는 데 필수적인 것은 아닙니다. - 세포 혼합물을 얼음 위에 30분 동안 놓고 42°C에서 10초 동안 열 충격을 가합니다. 튜브를 다시 얼음 위에 5분 동안 놓고 실온 LB(Luria-Bertani) 배지 1ml를 추가합니다. 박테리아 현탁액을 37°C에서 30분 동안 부드럽게 교반하면서 배양합니다.
- 1.5ml 플라스틱 튜브에 100ng의 플라스미드 DNA와 함께 플라스미드 DNA μg당 1-5 x 107 콜로니를 형성하는 50μl의 유능한 BL21(DE3) 세포를 부드럽게 혼합합니다.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
그림 1: 재조합 단백질 생산 및 동위원소 라벨링의 주요 단계 계획. 박테리아 형질전환에서 재조합 단백질 생산에 이르는 단계는 프로토콜의 단락 1에 설명된 대로 요약되어 있습니다.
그림 2: 재조합 타우 단백질 정제의 주요 단계 계획. 박테리아 세포 용해에서 재조합 단백질 정제에 이르는 단계는 프로토콜의 단락 2에 설명된 대로 요약되어 있습니다.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
이해 상충이 선언되지 않았습니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| pET15B 재조합 T7 발현 플라스미드 | 노바겐 | 69257 | -20°으로 유지; C |
| BL21(DE3) 형질전환 가능 대장균 박테리아 | New England Biolabs | C2527I | -80°을 유지합니다. C |
| 오토클레이브 LB 육수, 레녹스 | DIFCO | 240210 | 세균 성장 매체 |
| MEM 비타민은 100X | 시그마 | 58970C | 박테리아 성장 배지 보충제 |
| 15를 보완합니다. N, 13C-ISOGRO 완전 미디엄 파우더 | 시그마 | 608297 | 세균 성장 배지 보충제 |
| 15NH4Cl | 시그마 | 299251 | 동위원소 |
| 13C-글루코스 | 시그마 | 389374 | 동위원소 4° 유지; C |
| 프로테아제 억제제 정제 | Roche | 5056489001 | 1ml에 1정은 -20°으로 유지할 수 있는 40X 용액입니다. C |
| DNaseI | EUROMEDEX | 1307 | -20°을 유지합니다. C |
| 균질화기(EmulsiFlex-C3) | AVESTIN | 용해는 4°에서 실현됩니다. C | |
| PierceTM 염색되지 않은 단백질 MW 마커 | 피어스 | 266109 | |
| 활성 인간 MEK1 키나아제, GST 태그 | 시그마 | M8822 | }}-80°을 유지합니다. C |
| AKTÄ 순수 크로마토그래피 시스템 | GE 헬스케어 | FPLC | |
| HiTrap SP Sepharose FF (5mL 컬럼) | GE 헬스케어 | 17-5156-01 | 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼 |
| HiPrep 26/10 탈염 | GE 헬스케어 | 17-5087-01{{TAG_ 148}} | 단백질 탈염 컬럼 |
| PD MidiTrap G-25 | GE 헬스케어 | 28-9180-08 | 단백질 탈염 컬럼 |
| Tris D11, 97% D | Cortecnet | CD4035P5 | 중수소화 NMR 버퍼 |
| 5mm 대칭 Microtube SHIGEMI D2O ( 내부 & 외부 파이프 5개 세트) | Euriso-top | BMS-005B | NMR Shigemi Tubes |
| eVol 키트-전자 주사기 스타터 키트 | Cortecnet | 2910000 | 피펫팅 |
| Bruker 900MHz AvanceIII 삼중 공명 극저온 프로브헤드 | Bruker | 데이터 수집을 위한 NMR 분광계 | |
| 삼중 공명 극저온 프로브헤드가 있는 Bruker 600MHz DMX600 | Bruker | 데이터 수집을 위한 NMR 분광계 |
