DNA와 단백질의 상호작용을 연구하기 위한 원이색성 분광법(Circular Dichroism Spectroscopy) 기법

초록

출처: Arya, V., et al. CD 분광법은 DNA와 단백질의 상호작용을 연구합니다. J. Vis. 특급 (2022).

이 비디오는 ATP 의존성 염색질 리모델링 단백질이 있는 상태에서 DNA에서 발생하는 구조적 변화를 연구하기 위한 원이색성(CD) 분광학 기술을 보여줍니다. ATP 가수분해의 유무에서 측정된 CD 스펙트럼의 변화는 결합된 DNA에서 구조적 변화를 유도하는 리모델링자의 능력에서 ATP의 중요성을 나타냅니다.

프로토콜

1. 반응 성분의 작동 농도

1. CD에 대한 완충액의 작업 농도를 새로 준비하고 반응을 설정하기 전에 4°C로 유지하십시오.
   메모: 이 논문에 설명된 CD 반응의 경우 구성 요소의 작동 농도는 인산나트륨 완충액(pH 7.0) 1mM, ATP 2mM, DNA 500nM, 단백질 1μM, MgCl₂ 10mM, EDTA 50mM, ADAADiN 5μM입니다.

2. CD 큐벳 선택 및 준비

1. 고투명 석영 큐벳에서 CD 스펙트럼을 수집합니다. 직사각형 또는 원통형 큐벳을 사용합니다.
   메모: CD 석영 큐벳(공칭 부피 0.4mL, 경로 길이 1mm)을 이 논문에 설명된 모든 반응에 사용했습니다.
2. 큐벳 세척액을 사용하여 큐벳을 청소하십시오. 물에 1% 큐벳 세척액을 넣어 400μL의 용액을 만들고 큐벳에 붓고 37°C에서 1시간 동안 배양합니다.
3. 큐벳을 물로 여러 번 세척하여 큐벳을 청소합니다. 큐벳의 물이나 버퍼를 스캔하여 깨끗한지 확인하십시오.
   메모: 물 또는 버퍼는 0에서 1 mdeg 범위의 판독값을 제공해야 합니다.

3. 단백질 및 DNA 올리고뉴클레오티드의 제조

1. 반응에서 단백질의 부피를 50 μL 미만으로 유지하여 때때로 모호한 피크 형성을 유발하는 완충액 성분의 양을 최소화합니다. 분해를 방지하기 위해 실험 내내 단백질을 얼음 위에 두십시오.
2. 반응에 PAGE-purified DNA 올리고뉴클레오티드를 사용합니다.
   메모: 여기에 설명된 반응에서 DNA는 네이티브 및 열 냉각 형태(급속 냉각(FC) 및 저냉(SC))으로 사용되었습니다. 빠른 냉각은 DNA의 분자 내 결합을 촉진하여 더 많은 2차 구조를 생성합니다. 대조적으로, 느린 냉각은 DNA의 분자간 결합을 촉진하여 2차 구조를 줄입니다.
3. 빠른 냉각을 위해 가열 블록에서 DNA를 94°C에서 3분 동안 가열한 후 즉시 얼음으로 냉각합니다. 서냉식의 경우 DNA를 94°C에서 3분 동안 가열하고 분당 1°C의 속도로 실온으로 냉각시킵니다.

4. 기준선 스펙트럼을 기록하기 위한 대조군 실험 설정

1. 모든 반응에서 반응 부피를 300 μL로 유지하십시오. 다음과 같이 1.5mL 원심분리 튜브에서 총 5개의 기준선 반응을 하나씩 설정합니다. i) 완충액 + 물; ii) 완충액 + MgCl₂ + ATP + 물; iii) 완충액 + MgCl₂ + ATP + 단백질 + 물; iv) iii + EDTA 또는 ADAADiN; v) 완충액 + 단백질 + 물.

5. CD 스펙트럼을 기록하기 위한 실험 설정

1. 다음과 같이 1.5mL 원심분리 튜브에서 하나씩 총 5개의 반응을 설정합니다: i) 완충액 + DNA + 물; ii) 완충액 + DNA + MgCl₂ + ATP + 물; iii) 완충액 + DNA + MgCl₂ + ATP + 단백질 + 물; iv) iii + EDTA 또는 ADAADiN; v) 완충액 + DNA + 단백질 +물.

6. 녹음 스캔

1. 가스를 켜고 CD 분광계를 켭니다.
2. l을 켜십시오.amp 10-15분 후 수조를 켜고 홀더 온도를 37°C로 설정합니다.
3. CD 스펙트럼 소프트웨어를 엽니다.
   1. 온도를 37°C로 설정합니다.
   2. 파장 범위를 180 - 300nm로 설정합니다.
   3. 포인트당 시간을 0.5초로 설정합니다.
   4. 스캔 번호를 5로 설정합니다.
   5. Pro-Data Viewer를 클릭하고, 새 파일을 만들고, 실험 및 날짜에 대한 세부 정보로 이름을 바꿉니다.
4. 분해를 방지하기 위해 모든 반응 성분을 얼음 위에 보관하십시오. 원심분리 튜브에서 기준선과 반응을 하나씩 만들고 피펫팅으로 혼합합니다. 반응 혼합물을 큐벳으로 조심스럽게 옮기고 기포가 없는지 확인합니다.
5. 시간 경과 실험을 수행하는 경우 필요한 시간 동안 37°C에서 반응을 배양하고 스캔합니다.DNA, ATP, Mg⁺² 및 단백질이 포함된 버퍼에 EDTA를 추가하여 ATP 가수분해를 중지합니다.
6. ATPase 활성을 완전히 억제하기 위해 EDTA의 농도와 배양 시간을 증가시킵니다.
7. 소프트웨어의 해당 반응에서 기준선을 뺍니다(예: 기준선 1에서 반응 1을 뺍니다). CD 스펙트럼 소프트웨어 또는 데이터 플로팅 소프트웨어에서 데이터를 평활화합니다. 데이터 플로팅 software.
   에 데이터를 플로팅합니다. 메모: 해당 반응에서 기준선을 빼면 DNA의 순 CD 스펙트럼만 얻을 수 있습니다.

7. 데이터 분석 및 해석

1. eq (1)로 지정된 공식을 사용하여 밀리도 단위로 얻은 값을 평균 잔차 타원도로 변환합니다.
   
   여기서 S는 CD 신호(밀리도), c는 DNA 농도(mg/mL), mRw는 평균 잔류 질량, l은 경로 길이(cm)입니다.
2. 데이터 플로팅 소프트웨어를 사용하여 파장 및 평균 잔차 타원도에 대한 그래프를 플로팅하고 피크를 분석합니다.
3. 그래프를 플로팅하려면 Y축에서 평균 잔차 타원도를 선택하고 X축에서 파장을 선택하고 직선 그래프를 플로팅합니다.
   메모: 이 그래프는 다양한 형태의 DNA의 특징적인 피크를 제공합니다. 피크에 해당하는 DNA의 형태는 기존 문헌을 사용하여 확인할 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
아데노신 5'-트리포스페이트 디소듐 염 수화물	시그마알드리치	A2383
CD 쿼츠 큐벳	스타나	21-Q-1
Chirascan V100 CD 분광계	응용 광물리학	사용할 수 없음
EDTA 이나트륨 염 이수화물	증권 시세	43272
Hellmanex III 세척 용액	헬마	9-307-011-4-507
염화마그네슘 Hexahydrate	피셔 사이언티픽	M33-500
Sodium Phosphate 이염기성 무수	피셔 사이언티픽	S374-500
인산나트륨 Monobasic Monohydrate	피셔 사이언티픽	시즌 369-500
Synergy HT 마이크로플레이트 리더	(주)바이오텍	사용할 수 없음
트리스 베이스	피셔 사이언티픽	BP152-500

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