특정 항원을 검출하기 위한 Raman 분광법 기반 직접 면역분석

초록

출처: Hanson, C., et al. UV-Vis 및 Raman 분광법 면역분석 플랫폼 제작. J. Vis. 특급(2016).

이 동영상에서는 특정 표적 항원을 검출하기 위한 라만 분광법 기반 직접 면역분석 방법에 대해 설명합니다. 라만 프로브에 부착된 금 나노 입자의 표면에 흡착된 항체는 표적 항원과 상호 작용하여 특정 라만 스펙트럼을 생성하고, 이 스펙트럼은 이후에 검출됩니다.

프로토콜

1. UV-Vis/Raman 프로브 준비

1. 베어 AuNP 용액 준비
   1. ml당 약 1 x 1011 입자 농도의 AuNP 2ml 용액을 준비합니다.
      1. AuNP를 농축해야 하는 경우, 저결합 원심분리기 튜브에 2,000μl의 원료 AuNP를 채우고 5,000 x g에서 20분 동안 또는 상층액이 투명해질 때까지 원심분리합니다. AuNP 펠릿을 방해하지 않도록 주의하면서 피펫팅으로 상층액을 제거합니다.
      2. 나머지 AuNP 용액을 하나의 튜브에 결합하고 UV-Vis 측정을 얻고 선형 관계이므로 값을 알려진 농도와 비교하여 농도를 추정합니다.
2. 적절한 Raman 리포터 라벨링 비율 결정
   1. 메탄올에 용해된 라만 리포터의 작업 용액을 준비합니다. 이 농도는 사용된 리포터에 따라 다릅니다. 이 작업에서는 200μM의 작업 용액에서 3,3'-디에틸티아트리카르보시아닌 요오드화물(DTTC)을 준비합니다.
   2. 각 웰에 대해 최종 부피가 100μl라고 가정하고 96웰 플레이트의 첫 번째 행의 각 웰에 작업 리포터 용액을 충분히 추가하여 라만 리포터의 농도가 0.2μM에서 10μM가 되도록 합니다. 부피가 80μl가 되도록 각 웰에 충분한 HPLC 등급의 물을 추가합니다. 각 웰에 20μl의 AuNP를 추가하여 최종 부피를 만듭니다. 각 웰에 대해 100μl. 표 1에 예제가 제공되어 있습니다.
   3. plate-reading UV-Vis 분광 광도계를 사용하여 400 - 700 nm의 UV-Vis 스펙트럼을 측정합니다. 적절한 농도는 UV-Vis 스펙트럼에 대해 정의된 피크가 있는 가장 높은 농도입니다. AuNP에 대한 라만 리포터의 가장 높은 농도 비율이 발견될 때까지 농도를 증가시키면서 2.2.2단계를 반복합니다.
      메모: 염료와 AuNP 모양, 크기 및 제조업체는 적절한 농도에 영향을 미칩니다. 따라서 사용된 구성 요소에 따라 나열된 단계를 평가하고 변경해야 합니다. 이 프로토콜에는 양전하를 띤 염료의 사용이 포함되었습니다. 이와 같이, 음전하를 띤 AuNP를 사용함으로써 AuNP와 리포터 사이의 결합이 개선되었습니다. 이것은 구연산염 캡 AuNP를 사용하여 수행되었습니다. 자세한 내용은 토론 섹션을 참조하십시오.
3. 라만 리포터 및 PEG-Ab를 AuNP에 결합
   1. 이전에 결정된 농도로 AuNP 및 라만 리포터의 1.5ml 배치 2개를 준비하여 라만 리포터가 실온에서 30분 동안 AuNP에 결합할 수 있도록 합니다.
   2. AuNP 및 Raman 리포터 용액의 한 배치에 PEGylated 항체(PEG-Ab)를 추가하여 항체 대 입자의 200:1 비율을 생성합니다. 이 솔루션은 테스트 샘플용입니다. 별도의 마이크로 원심분리기 튜브에서 PEGylated 항원을 AuNP 및 Raman 리포터 용액의 다른 배치에 대조군으로 사용할 입자에 대한 항체 200:1 비율로 추가합니다. 용액을 실온에서 30분 동안 배양합니다.
      참고: 항체와 입자의 비율은 사용된 AuNP 및 염료에 따라 다르며 각 개별 사례에 맞게 최적화해야 합니다. 여기서 목표는 AuNP 프로브가 결합할 항체의 비율을 가장 높게 유지하면서 입자의 응집을 방지하는 것입니다. 다음 방정식을 사용하여 함께 추가할 적절한 볼륨을 결정합니다.
      
      여기서 V는 부피이고 C는 ml당 입자 또는 항체로 표시되는 농도입니다. 최종 부피는 약 1.5ml여야 합니다.
4. mPEG-SH로 AuNP 표면의 나머지 부위를 차단합니다.
   1. 물을 사용하여 고체 메톡시 폴리에틸렌 글리콜 티올을 200μM 농도로 용해시켜 mPEG-SH를 제조합니다. mPEG-SH가 완전히 용해될 때까지 용액을 소용돌이
   치십시오.
   2. 2.3단계에서 만든 AuNP-PEG-Ab 용액에 40,000:1 비율로 mPEG-SH를 추가합니다. 용액을 실온에서 10분 동안 배양하여 금 나노 입자의 나머지 부위가 차단되었는지 확인합니다. 다음 방정식을 사용하여 함께 추가할 적절한 볼륨을 결정합니다.
      
      여기서 V는 부피이고 C는 ml당 입자 또는 항체로 표시되는 농도입니다. 최종 부피는 약 1.5ml여야 합니다.
5. 기능화된 라만 프로브를 복구합니다.
   1. 5,000 x g의 원심분리기 입자를 저결합 원심분리기 튜브에서 20분 동안 또는 상층액이 투명해질 때까지 사용합니다. AuNP를 방해하지 않도록 주의하면서 피펫팅으로 상층액을 제거합니다.
   2. 이전에 만든 1x PBS 용액 1ml로 입자를 재현탁합니다. 소량의 용액(3μl)에 대한 UV-Vis 측정을 수행하여 AuNP 농도를 추정하고 결과를 알려진 AuNP 농도의 측정값과 비교합니다. 최종 용액이 ml당 최소 1 x 10¹¹ 입자가 되도록 부피를 조정합니다.
   3. 면역분석 플레이트의 기능화에 사용될 때까지 용액을 4°C에서 보관하십시오. 일주일 이내에 솔루션을 사용하십시오.

표 1. DTTC 희석 예. DTTC의 다양한 희석 및 관련 부피의 원료 DTTC, 금 나노 입자 용액 및 물.

시리즈 분 년 분 개 분 개 호 분 분 개 호 분 년 조 분 분 조 분 의

	각 구성 요소에 추가할 볼륨(ml)
DTTC 최종 농도(mM)	DTTC 작업 솔루션(200mM)	AuNP	물
0.2	0.1	20	79.9
0.6	0.3	20	79.7
1	0.5	20	79.5
2	1.0	20	79
5	2.5	20	77.5
7	3.5	20	76.5
10	5.0	20	75

2. 면역분석 플레이트 준비

1. 원하는 항원을 면역분석 플레이트에 결합합니다.
   1. 폴리스티렌 웰을 채우기에 충분한 희석된 항원(50μg/ml)을 준비합니다. 용액을 와류로 만들고 즉시 용액을 플레이트 웰에 첨가하십시오. 항원이 실온에서 1시간 동안 플레이트에 결합하도록 합니다.
2. 결합되지 않은 항원을 씻어냅니다.
   1. 용액을 폐기 용기에 버리고 종이 타월로 덮인 탁자에 접시를 부딪쳐 과도한 항원 용액을 제거합니다.
   2. 우물에 TBST를 추가하여 표면을 세척한 다음 앞에서 언급한 것과 같은 방식으로 세척을 제거합니다. 이 단계를 두 번 더 반복합니다.
3. 비특이적 결합을 방지하기 위해 플레이트에 남아 있는 결합 부위를 차단합니다.
   1. 플레이트의 각 웰에 70μl의 HSA 차단 용액을 추가하고 실온에서 30분 동안 배양합니다.
   2. 3.2단계에 지정된 것과 동일한 절차를 사용하여 플레이트를 제거하고 헹굽니다. 플레이트를 덮고 나중에 사용할 준비가 될 때까지 4 °C에서 건조된 상태로 보관하십시오.
4. 면역분석 플레이트를 기능화합니다.
   1. 섹션 2에서 준비한 프로브 나노 입자 70μl를 96웰 플레이트의 첫 번째 컬럼에 추가하고 1:2 연속 희석을 사용하여 후속 컬럼을 희석합니다. 플레이트를 최소 1시간 동안 배양합니다. 면역분석 플레이트를 준비하는 방법의 예가 그림 1에 나와 있습니다.
   2. 3.2단계에서 설명한 대로 TBST로 플레이트를 5번 세척하고 AuNP를 적절하게 폐기해야 합니다. 최종 세척 후 각 웰에 70μl의 1x PBS를 추가하고 플레이트 씰로 덮습니다.
      알림: 제어 샘플은 명확해야 합니다. 비특이적 결합이 발생한 경우 제어 샘플은 테스트 샘플과 유사한 색상을 갖게 됩니다.
5. UV-Vis 및 Raman 분광법에 의한 테스트 분석 감도.
   1. 각 웰에 대해 플레이트 판독 UV-Vis 분광 광도계를 사용하여 400 - 700nm 범위의 UV-Vis 스펙트럼을 측정합니다.
   2. 도립 라만 현미경을 사용하여 AuNP 프로브가 있는 웰 표면에 대물렌즈의 초점을 맞춥니다. 우물의 라만 스펙트럼을 얻습니다. 1,800cm-1에서 ^400cm-1 범위의 스펙트럼을 수집합니다. 모든 웰에 대해 이 단계를 반복합니다.
   3. 적절한 스펙트럼 소프트웨어를 사용하여 라만 스펙트럼에 대해 11차 다항식 베이스라인 보정을 수행하고 UV-Vis 스펙트럼에 대해 3차 다항식 보정을 수행합니다.
   4. 적절한 스펙트럼 소프트웨어를 사용하여 라만 및 UV-Vis 스펙트럼을 정규화합니다. 최대값을 1로 설정하고 다른 모든 값을 적절하게 조정합니다. 라만 스펙트럼을 정규화하려면 고유한 폴리스티렌 피크를 선택하여 1로 설정하고 그에 따라 다른 모든 값을 스케일링합니다.
   5. 적절한 스펙트럼 소프트웨어를 사용하여 각 스펙트럼에 대해 피크 적분을 수행합니다. 라만 스펙트럼의 경우, 라만 리포터를 나타내는 피크는 폴리스티렌 피크가 없는 영역에 있어야 합니다. 피크 적분을 수행하려면 원하는 피크에 대한 적분 경계를 지정하고 대조군을 포함한 모든 샘플에 대해 원하는 피크 면적을 기록합니다.
   6. 관심 있는 평균 피크 영역을 AuNP 농도 로그의 함수로 플로팅하고, 각 점에 대한 오차 막대는 관련 표준 편차를 나타냅니다. 이러한 검량점을 4-파라미터 로지스틱 곡선에 맞춥니다.
   7. blank 샘플에 대한 관심 피크 영역의 평균을 구하여 블랭크의 평균값을 결정합니다. 이 영역의 표준 편차를 결정하십시오. 이것은 블랭크의 표준 편차입니다.
   8. 이전 단계에서 분석된 동일한 피크에 대해 가장 낮은 농도에 대한 해당 피크 영역의 표준 편차를 찾습니다.
   9. Representative results 섹션에 지정된 대로 검출의 공백 및 하한의 한계를 계산합니다. 이 값을 4PL 보정 곡선과 함께 사용하여 AuNP 농도 측면에서 LLOD를 결정합니다.

결과

그림 1. 준비된 면역분석 플레이트. 준비된 면역분석 플레이트의 이미지. A부터 E까지는 테스트 샘플이고 F부터 H까지는 제어 샘플입니다. 열 1에는 희석되지 않은 나노 입자가 포함되어 있으며 모든 후속 열에는 AuNP 프로브 농도의 절반

이 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
60nm 금 나노 입자	테드 펠라, Inc.	15708-6	이들은 구연산염으로 덮인 금 나노 입자입니다. 라만 리포터와 AuNP 표면 전하의 관계 및 AuNP 및/또는 라만 리포터의 적절한 선택에 대한 중요성에 대한 논의를 참조하십시오.
중탄산나트륨	피셔 사이언티픽	시즌 233-500
메탄올	Pharmco-Aaper	339000000
트리스 완충 식염수(10x) pH 7.5	사이테크	미정999
병 상단 여과 장치	폭스바겐	97066-202
트윈 20 (폴리 소르 베이트 20)	사이테크	TWN500	세척 단계를 위한 유화제로 사용됩니다.
인산염 완충 식염수 10x 농축액, pH 7.4	사이테크	PBD999
단백질 LoBind 튜브 2.0 ml	Eppendorf 튜브	22431102	LoBind 튜브는 단백질과 AuNP가 튜브 표면에 결합하는 것을 방지합니다.
단백질 LoBind 튜브 0.5 ml	Eppendorf 튜브	22431064	LoBind 튜브는 단백질과 AuNP가 튜브 표면에 결합하는 것을 방지합니다.
마이크로플레이트 장치 UniSeal	GE 헬스케어	전화: 7704-0001	기능화된 플레이트를 밀봉하고 보관하는 데 사용됩니다.
분석 플레이트, 낮은 증발 뚜껑, 96 웰 플랫 바닥	코스타	3370
HPLC 등급의 물	시그마 알드리치	270733-4L
3,3'-디에틸티아트리카르보시아닌 요오드화물(DTTC)	시그마 알드리치	381306-250MG	라만 리포터
mPEG-Thiol, MW 5,000 - 1 그램	레이산바이오(주)	MPEG-SH-5000-1G
OPSS-PEG-SVA, MW 5,000 - 1 그램	레이산바이오(주)	옵스-페그-SVA-5000-1g	OPSS-PEG-SVA는 NHS 말단을 가지고 있습니다.
마우스 IgG, 전체 분자 제어	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	31903	항원
염소 안티 마우스 IgG (H + L) 교차 흡착 된 2 차 항체	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	31164	항체
Human Serum Albumin Blocking 솔루션	시그마 알드리치	A1887-1G	대신 소 혈청 알부민을 사용할 수 있습니다.
UV-Vis 분광 광도계	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	나노드롭 2000c
UV-Vis 분광 광도계	(주)바이오텍	시너지 2
자체 제작 785nm 도립 라만 현미경 장치	해당 사항 없음	해당 사항 없음	도립 라만 현미경은 웰 플레이트의 표면에 적절하게 초점을 맞추는 데 가장 적합합니다. 그렇지 않으면 96웰 플레이트의 높이 때문에 매우 낮은 배율이 사용됩니다. 공급업체에서 구입하는 것보다 저렴하기 때문에 자체 구축 시스템을 사용했습니다. 그러나 상업적으로 이용 가능한 모든 도립 라만 현미경 시스템을 사용할 수 있습니다.

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