수막구균성 수막염을 유발하기 위해 마우스 모델로 수막구균의 수막구균 내 전달(Intracisternal Delivery of meningococci into mouse models to induce meningococcal meningitis)

초록

출처: Pagliuca, C., et al., Inducing Meningococcal Meningitis Serogroup C in Mice via Intracisternal Delivery. J. Vis. 특급 (2019)

이 비디오에서는 Neisseria meningitidis를 마우스 모델로 시추 내 전달하여 수막염 감염을 생성하는 방법을 보여줍니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 마우스의 수조 내 주입

참고: 전체 절차는 무균 상태를 유지하기 위해 층류 캐비닛에서 수행됩니다.

1. 특정 병원체가 없는 조건에서 사육 실험실 마우스(8주령, 암컷 Balb/c). 음식 알갱이와 물을 자유롭게 제공하십시오.
2. 실험을 시작하기 전 1주일 동안 동물들을 새로운 환경에 정착
시키세요.
3. 실험을 시작하기 전에 체중을 측정하고 체온을 평가합니다.
   메모: 8 주 된 근친 교배 Balb / c 암컷 마우스의 무게는 평균 약 19g입니다. 실험용 쥐의 평균 온도는 생리학적으로 36-38°C입니다.
4. 동물의 목을 긁어내고 70% 에탄올로 복부 부위를 청소하고 감염 약 2-3시간 전에 25G 바늘 0.5mm x 16mm를 사용하여 쥐 복부의 오른쪽 하단 사분면에 ip
   메모: 복강내 주사는 요로 방광, 맹장 등과 같은 복부 장기의 손상을 방지하기 위해 쥐 복부의 오른쪽 하단 사분면에 수행되었습니다. 감염 전에 철 덱스트란 형태의 외인성 철분 공급원을 동물에게 투여하면 숙주에서 박테리아 증식이 촉진됩니다.
5. 2-3시간 후 케타민(50mg/kg)과 자일라진(3mg/kg), 안과 윤활제로 동물 마취를 수행합니다.
6. 발가락을 꼬집었을 때 통증 반응이 없는지 확인하여 마취 깊이를 확인하십시오.
7. 마우스를 흉골 욕창에 놓고 척추를 똑바로 유지하기 위해 팔다리와 경추를 조심스럽게 스트레칭합니다.
8. 30G 바늘 x 8mm.
   의 주사기를 로드하기 전에 박테리아 현탁액을 부드럽게 혼합하여 일관된 현탁액을 유지하십시오. 메모: 주입 시간에 가능한 한 가깝게 박테리아 현탁액을 준비하십시오. 한편, 실온에서 보관하십시오.
9. 해동 후 세균 역가(CFU/mL)를 기준으로 총 감염 동물 수(동물 수당 CFU 세균 투여량)에 대해 사용할 총 CFU 계산을 진행합니다. 해동 후 박테리아 역가(CFU/mL)와 n 마우스의 감염에 유용한 총 CFU(해동 후 세균 역가 CFU: ml = 총 CFU: x) 사이의 비율을 적용하여 총 CFU를 얻기 위해 바이알에서 취해야 할 정확한 부피의 계산을 진행합니다. 감염될 동물의 총 수에 대한 최종 부피를 설정합니다.
   메모: 이 실험에서는 동물당 10⁴에서 10⁹까지의 광범위한 역가가 사용되었습니다.
10. 70% 에탄올로 수술 부위를 청소하십시오.
11. 바늘을 사용하여 주입 지점을 확인하고 수막구균(야생형 균주 및 동인성 돌연변이 균주)의 확립된 CFU 또는 대조군으로 철 덱스트란(5mg/kg)이 보충된 GC 육수를 30G 바늘 x 8mm를 사용하여 후두 버 구멍을 통해 마우스의 수조 마그나에 총 10μL씩 주입합니다.
    1. 두개경부 접합부, 특히 등쪽 지주막하 공간에 바늘을 삽입하여 수조 접종을 수행합니다. Ventroflex는 이 공간을 접근 가능하게 만들기 위해 머리를 움직입니다.
    2. 간단히 말해서, 동물을 옆으로 누운 자세로 눕히고, 귀를 방해하지 않게 하고, 목을 적당히(90-100°) 구부립니다. 목과 머리의 정중선(코에서 후두부까지)이 탁상과 완벽하게 평행한 위치에 있는지 확인하십시오.
    3. 아틀라스 날개를 만지고 겹쳐서 축 회전을 제거하는지 확인합니다. 일반적으로 바늘이 후두부에 들어갈 가능성이 가장 높은 정중선에 자연스러운 움푹 들어간 곳을 만질 수 있습니다.
    4. Neisseria를 가진 쥐의 주사 후에 주사기와 바늘을 안전하게 버리십시오.
12. 동물을 우리에 넣고 깨어나 움직임이 완전히 회복될 때까지 기다립니다.
13. 감염된 쥐가 있는 케이지를 층류 캐비닛 아래에 보관하십시오.
14. 감염 후 24시간 동안 마우스를 모니터링하여 혼수 상태 척도에 따른 혼수 상태의 임상 징후를 확인합니다. 혼수 상태: 1 = 혼수상태, 2 = 등을 돌린 후 똑바로 서 있지 않음, 3 = 30초 이내에 똑바로 서, 4 = 5초 이내에 똑바로 서, 최소한의 보행 활동, 5 = 정상.
    메모: 동물에서 통증이 기록되었을 때, 멜록시캄(연구 기간 동안 5mg/kg i.p.)을 사용한 진통제를 투여했다.

2. 동물 생존 및 CFU 수

1. 동물의 생존
   1. i.cist. 경로로 동물을 감염시키기 위해 다양한 용량(마우스당 10⁴에서 10⁹ CFU 범위)으로 박테리아 접종을 준비합니다.
   2. 대조군 마우스에도 같은 방법으로 철 덱스트란(5mg/kg)을 보충한 GC 육수를 접종합니다.
   3. 임상 증상에 대해 동물을 모니터링합니다: 주름진 털, 구부정한 외모, 저체온증, 체중 감소, 무기력 또는 빈사 상태, 전체 실험 기간 동안 168시간(7일) 동안 매일 하루에 두 번 말.
   4. 매일 디지털 저울과 직장 체온계를 사용하여 체중과 체온을 각각 측정하십시오.
   5. 일주일 동안 생쥐의 생존을 기록하십시오.
      메모: 감염 후 동물의 자연사를 기록하고, 혼수상태 값이 2에 도달하거나 관찰 후 168시간 이상 생존한 동물은 안락사됩니다.
   6. 혼수 상태 값이 2 또는 관찰 시간 동안 생존한 마우스에 케타민(50mg/kg) 및 자일라진(3mg/kg)을 투여하고 안과 연고를 바르십시오.
   7. 발가락 꼬집음으로 인한 통증 반응이 없는지 확인하십시오.
   8. 자궁경부 탈구에 의한 생쥐의 안락사를 수행하고 통계 분석을 위해 죽은 것으로 기록합니다.
   9. 감염된 동물에 대한 동물 생존 또는 CFU 계수 분석을 진행합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
알람 온도계	테스토	9000530	장치
BD 마이크로 파인 시린지	BD (영어)	320837	U-100 인슐린
BD Plastipak 주사기 1ml 25GA 5/8in	BD (영어)	300014	05x16밀리미터
BD Plastipak 주사기 5ml	BD (영어)	308062	07 x 30 밀리미터
BIOHAZARD AURA B 수직 층류 캐비닛	바이오 에어 s.c.r.l.	오라 B3	장치
C150 CO2 인큐베이터	바인더	9040-0078	장치
Diete 표준 인증서	Mucedola s.r.l.	4RF21	동물을 위한 음식 펠릿
Dumont Hp 핀셋 5 스테인리스 스틸	F.S.T. 바이 듀몬트	AGT5034	0,10 x 0,06mm 팁
전자 저울	기베르티니	유럽연합(EU)-C1200	최대 1200g, d=0.01g, T=-1200g
철 덱스트란 용액	시그마-알드리치	D8517-25ML
케타민	끼워 넣다
미생물 안전 작업대 BH-EN 및 BHG Class II	빠른	BH-EN 2004
마이크로 원심분리기 튜브 1.5ml	낙인	PP780751	스크류 캡 PP, grad
마우스 취급 겸자	에프에스티	11035-20	톱니 모양의 고무; 그립 표면:15 x 20 mm
천연 라텍스 장갑	메디카	엠101
Touch N Tuff 일회용 니트릴 장갑	안셀	92-500
자일라진	끼워 넣다

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