Murine 모델에서 감염 부위의 호중구 모집 역학 및 박테리아 부담 모니터링

초록

출처: Anderson, L. S., et al. 황색포도상구균 감염에 대한 선천성 면역 반응을 평가하기 위한 마우스 모델. J. Vis. 특급 (2019).

이 비디오는 GFP 발현 호중구를 가진 면역 저하 형질전환 마우스의 감염 부위에서 호중구 모집 역학을 연구하기 위한 생체 내 이미징을 보여줍니다. 발광 박테리아를 주입하여 감염을 일으키는 것과 관련이 있습니다. 이는 감염 부위에 호중구가 동원되도록 유도하며, 이미징을 통해 추적이 이루어집니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 마우스 소스 및 하우징

1. C57BL/6J 유전적 배경에서 LysM-eGFP 마우스를 파생합니다. C57BL/6J 배경에서 LysM-EGFP 마우스와 MyD88^-/- 마우스를 교배하여 LysM-EGFP×MyD88^-/- 마우스를 파생합니다.
2. 사육장에 있는 집 쥐. 이 연구를 위해 동물들은 수술 전에 동물들을 그룹으로 수용하고 수술 후에는 단독 수용했습니다. 생후 10-16주 사이의 쥐를 사용하십시오.

2. 박테리아 준비 및 정량화

1. 관심 생물 발광 S. aureus 균주를 -80 °C 보관에서 제거하여 얼음에서 해동합니다. 5% 소 혈액 한천 플레이트에 줄무늬를 그립니다. 줄무늬 플레이트를 37°C의 가습 인큐베이터에서 하룻밤(16시간) 동안 배양합니다.
   메모: 이 프로토콜에서는 ALC2906 SH1000 균주가 사용되었습니다. 이 균주는 Photohabdus luminescens의 luxABCDE 리포터 카세트에 융합된 페니실린 결합 단백질 2 프로모터가 있는 셔틀 플라스미드 pSK236을 함유하고 있습니다.
2. 순수 mL당 TSB 분말 0.03g을 혼합하여 트립틱 소이 육수(TSB)를 준비하고 TSB를 오토클레이브로 만들어 살균합니다. 냉각되면 멸균 기술을 사용하여 필요한 항생제를 첨가하십시오. 이 프로토콜에서 TSB에 10μg/mL의 chloramphenicol을 추가하여 생물발광 luxABCDE 카세트를 포함하는 pSK236 셔틀 플라스미드의 발현을 선택합니다.
3. S. aureus 플레이트에서 10μg/mL 클로람페니콜이 함유된 TSB로 3-4개의 개별 콜로니를 선택하여 하룻밤 배양을 시작합니다. 37°C의 배양 셰이커에서 밤새(16시간) 동안 박테리아를 배양합니다.
4. 10μg/mL 클로람페니콜로 샘플을 TSB에 1:50으로 희석하여 야간 배양에서 새로운 박테리아 배양을 시작합니다. 200 rpm 및 37 °C의 인큐베이팅 셰이커에서 배양.
5. S. aureus를 분리한 후 2시간 후에 분광 광도계에서 600nm(OD₆₀₀)의 광학 밀도를 모니터링합니다. OD₆₀₀ 대 시간을 관찰하여 중간 로그 위상 성장을 찾습니다. ALC2906 SH1000 균주의 경우 0.5의 OD₆₀₀은 중간 로그이며 1 x 10⁸ CFU/mL의 농도에 해당합니다(그림 1).
6. OD₆₀₀이 0.5일 때 얼음처럼 차가운 DPBS로 박테리아를 1:1로 씻어냅니다. 3,000 x g 및 4°C에서 10분 동안 박테리아를 원심분리합니다.상층액을 조심스럽게 기울인 후 냉각된 DPBS와 와류를 철저히 추가합니다. 3,000 x g 및 4°C에서 10분 동안 다시 한 번 원심분리기를 사용합니다.
7. 상등액을 조심스럽게 디캔팅하십시오. 박테리아 펠릿을 원하는 농도로 재현탁시킵니다. 이러한 연구의 경우 ALC2906 SH1000 3mL를 수집하고 약 2 x 10⁸ CFU/mL의 박테리아 농도와 상관관계가 있는 PBS 1.5mL에 재현탁합니다. 사용할 때까지 얼음에 박테리아를 보관하십시오.
8. 박테리아 농도를 확인하려면 박테리아 샘플 100μL를 PBS에서 1:10,000 및 1:100,000으로 희석합니다. 한천 플레이트에 20 μL 분취량을 플레이트화합니다. 37 °C의 가습 인큐베이터에서 16 시간 동안 배양합니다. 전체 검사로 CFU를 계산하고 다음 날 박테리아 농도를 계산합니다.

3. 절제 피부 상처 및 황색포도상구균 접종

1. 복강내 주사를 통해 각 마우스에 0.03mg/mL 부프레노르핀 염산염(~0.2mg/kg) 100μL 를 투여합니다.
2. 주사 후 20분 후에 2-4%의 이소플루란이 포함된 2-3LPM 산소가 있는 챔버에 2-4마리의 마우스를 놓습니다. 마우스가 완전히 마취되면 2-4% 이소플루란이 포함된 2-3LPM 산소에 연결된 콧방울로 마우스를 한 번에 하나씩 옮깁니다. 엄지와 검지 사이의 각 뒷발을 단단히 꼬집어 마우스가 완전히 마취되었는지 확인합니다. 동물이 꼬집음에 반응하지 않으면 다음 단계로 진행하십시오.
3. 전기 이발기로 마우스 뒷면의 1인치 x 2인치 부분을 면도하고 깨끗한 물티슈나 거즈를 사용하여 털 깎기 부분을 제거합니다. 제모 로션은 과도한 염증을 유발할 수 있으므로 사용하지 마십시오.
4. 먼저 포비돈 요오드에 적신 거즈 10%로 마우스 뒷면을 청소한 다음 에탄올에 적신 거즈 70%로 마우스 뒷면을 청소합니다. 수술 부위의 중심에서 바깥쪽으로 이동하여 나선형 패턴으로 해당 부위를 청소합니다. 수술 전에 수술 부위가 마를 때까지 약 1분 정도 기다립니다.
5. 면도한 마우스 뒷면을 두 손가락 사이로 느슨하게 잡고 준비된 수술 부위 중앙에 멸균 6mm 펀치 생검을 단단히 누릅니다. 피부를 팽팽하게 당기지 마십시오.
   1. 펀치 생검을 비틀어 윤곽의 적어도 한 부분에서 피부를 완전히 절단하는 피부에 원형 윤곽을 만듭니다. 밑에 있는 근막이나 조직을 자르지 않도록 주의하십시오.
   2. 멸균 가위와 집게를 사용하여 펀치 생검에 의해 각인된 원형 패턴에 따라 표피와 진피를 자릅니다.

4. S. aureus 접종

1. 인슐린 주사기 28g에 원하는 생물 발광 박테리아 접종제를 채웁니다. 이 연구에서는 1 x 10⁸ CFU/mL(50 μL)의 농도를 투여합니다. 100μL 이상의 부피를 투여하지 마십시오.
2. 마우스 뒤쪽의 상처 중앙에 있는 근막과 조직 사이에 50μL의 접종제를 주입합니다. 접종제가 상처 중앙에 거품을 형성하여 누출 또는 분산을 최소화하도록 합니다.
   1. 진피를 옆으로 당기고 주사기를 조직과 거의 평행하게 잡고 근막의 피어싱을 나타내는 저항의 급격한 감소가 느껴질 때까지 주사기를 조직에 천천히 밀어 넣습니다. 주사기를 상처 중앙으로 조심스럽게 유도하고 접종제를 천천히 분사합니다. 동물에서 주사기를 천천히 제거하십시오.
3. 위에서 설명한 대로 감염되지 않은 동물의 상처에 동일한 양의 멸균 PBS를 주입합니다.
4. 동물을 우리로 되돌립니다. 케이지를 열 램프 아래 또는 가열 패드 위에 놓고 마취에서 회복될 때까지 동물을 모니터링합니다.

5. 생체 내 BLI 및 FLI

1. 기기 소프트웨어를 통해 전체 동물 이미저를 초기화합니다. 2-4% 이소플루란과 함께 2-3LPM 산소를 공급받는 챔버에서 마우스를 마취합니다. 이미저 내부의 노즈콘에 마취를 전달합니다.
2. 부상 및 감염된 쥐를 이미저에 넣습니다. 상처가 가능한 한 평평하도록 마우스를 배치합니다. 다음 시퀀스 설정을 사용하여 마우스를 이미지화합니다.
   1. 이미징 모드로 Luminescence(발광) 및 Photograph(사진)를 선택합니다. 노출 시간은 작은 비닝에서 1분이며 F/stop 1(발광) 및 F/stop 8(사진)입니다. 방출 필터가 열려 있습니다. Acquire 버튼을 클릭하여 이미지를 기록합니다.
   2. 이미징 모드로 형광(Fluorescence)과 사진(Photograph)을 선택합니다. 노출 시간은 여기 파장이 465/30nm이고 램프 강도가 높을 때 520/20nm의 방출 파장에서 작은 비닝과 F/stop 1(형광) 및 F/stop 8(사진)에서 1초입니다. Acquire 버튼을 클릭하여 이미지를 기록합니다.
3. 동물을 우리로 되돌리고 마취에서 회복될 때까지 모니터링합니다.
4. 위에서 설명한 대로 매일 마우스를 이미지화합니다.

6. 이미지 분석

1. 정량화할 이미지를 엽니다.
2. 영상에 있는 각 마우스의 주변 피부를 포함한 전체 상처 영역에 큰 원형 관심 영역(ROI)을 배치합니다. 호중구 in vivo FLI EGFP 신호 및 in vivo BLI S. aureus 신호는 며칠 후에 상처 가장자리를 넘어 확장되며 이러한 연구에 포함되었습니다(그림 2A 및 2B). ROI 측정을 클릭하고 각 마우스의 평균 플럭스 값을 기록합니다. 시간 대비 각 신호의 평균 플럭스(p/s)를 플로팅합니다.
3. 상처 부위의 호중구 또는 황색포도상구균의 절대 수를 원하는 경우, 다음 실험을 실시한다.
   1. 호중구 수를 in vivo FLI EGFP 신호와 연관시키기 위해 위에서 설명한 대로 C57BL/6J 마우스를 감기고 LysM-EGFP 또는 LysM-EGFPxMyD88^-/- 공여자의 골수 유래 호중구(5 x 10⁵ to 1 x 10⁷)를 다른 상처 위에 직접 전달합니다. 위에서 설명한 바와 같이 이미지를 만들고 in vivo FLI EGFP 신호를 알려진 호중구의 양과 연관시킵니다.
   2. S. aureus CFU를 in vivo BLI 신호와 연관시키기 위해 위에서 설명한 대로 마우스에 상처를 입히고 감염시킵니다. 감염 후 1일차에 생체 내 BLI는 마우스로부터 신호를 보내고 즉시 사체를 안락사시키고 냉각시킵니다. 상처를 절제하고, 조직을 균질화하고, 하룻밤 배양을 위해 한천에 박테리아 희석액을 플레이트로 고정합니다. 다음 날, 군체를 세어 상처당 CFU를 계산합니다.
4. 상처 치유를 측정하려면 상처 가장자리에 원형 ROI를 끼우고 상처 면적(cm²)을 측정하고 기준선 대 시간으로부터의 분수 변화를 플롯합니다(그림 2C).

결과

그림 1: ALC2906. 3-4 ALC2906 SH1000 콜로니에 대한 OD₆₀₀과 CFU 계수 간의 상관관계를 한천 플레이트에서 선택하고 하룻밤 배양을 위해 10μg/mL 클로람페니콜과 함께 TSB로 옮겼습니다. 다음날, 현탁액을 10μg/mL 클로람페니콜이 함유된 TSB로 1:50으로 분할하고 배양했습니다. 600 nm (OD₆₀₀)에서의 광학 밀도는 분광 광도계를 사용하여 2 시간 후 일정한 간격으로 측정되었습니다. 각 측정에서 박테리아를 얼음처럼 차가운 PBS에서 1:100,000으로 희석하고 하룻밤 배양을 위해 한천 플레이트에 분주했습니다. CFU는 초기 농도를 계산하기 위해 다음 날 계산되었으며 OD₆₀₀과 상관관계가 있었습니다. N = 3, 실험당 4개의 서로 다른 OD₆₀₀ 측정

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
14mL 폴리프로필렌 라운드 바닥 튜브	송골매	352059
6mm 일회용 생검 펀치	인테그라 밀텍스	33-36
생물 발광 S. 아우레우스	로이드 밀러, 존스 홉킨스	재질 보기 ALC 2906 SH1000
소 혈액 한천, 5%, 하디 진단	폭스바겐	제10118-938
부프레노프린 염산염 주사 가능	서양 의료 공급	7292	0.3 mg/mL
C57BL/6J 마우스	잭슨 라브라토리	664
클로람페니콜(결정성 분말)	Fisher BioReagents	BP904-100
DPBS(1배)	지브코	14190-144
인슐린 주사기	벡턴, 딕슨 앤 컴퍼니	329461	.35mm(28G) x 12.7mm(1/2인치)
IVIS Spectrum In Vivo 이미징 시스템	퍼킨 엘머	124262
리빙 이미지 소프트웨어 – IVIS 스펙트럼 시리즈	퍼킨 엘머	128113
LysM-eGFP 마우스	토마스 그라프, 알버트 아인슈타인 뉴욕 대학	해당 없음
Microvolume 분광 광도계	써모피셔 사이언티픽	ND-2000
MyD88 KO 마우스	잭슨 라브라토리	9088
부직포 스폰지	AMD- Ritmed Inc	A2101-채널	5cm × 5cm
포비돈 요오드 10% 용액	애플리케어	697731
트립틱 소이 브로스	벡턴, 딕슨 앤 컴퍼니	211825

호 호 년 의 년 년 의