쥐 모델에서 안구 표면 염증을 유도하는 방법

초록

출처: Singh, J., et al. 안구 표면 염증 유도 및 관련 조직 수집. J. Vis. 특급 (2022년)

이 비디오는 쥐 모델에서 안구 표면 염증 및 마이봄샘 기능 장애를 유도하는 방법을 보여줍니다. 면역원을 사용하여 마우스의 면역 체계를 자극한 후 동일한 면역원으로 재자극하면 안구 표면 염증이 촉진되어 호중구에서 생성된 응집체를 통한 마이봄샘 분비물이 막히고 안구건조증을 유발합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 쥐 안구 표면 염증의 유도

1. 면역 준비를 위한 면역원 준비를 수행합니다.
   1. 생리수에 오브알부민(OVA, 50 mg/mL)과 백일해 독소(100 μg/mL)를 섞어 면역원을 1:1 비율로 혼합하여 면역원을 바로 준비합니다><(재료 표 참조). 주의: 층류 안전 캐비닛에서 백일해 독소의 개봉, 재구성 및 면역원 준비를 수행합니다. 보호복을 착용하고 피부와의 접촉을 피하십시오.
   2. 면역원과 보조제 혼합물을 실온에서 30분 동안 배양하고 100μL를 1mL 주사기에 넣습니다.
   3. 마취되지 않은 마우스에서 면역원 용액의 복강 내 주사를 수행합니다.
      1. 케이지 그리드를 잡는 동안 꼬리를 마우스로 부드럽게 잡습니다. 엄지와 검지 사이의 등과 목 부위의 피부를 단단히 잡고 약지와 새끼 손가락 사이의 꼬리와 하지를 손바닥에 고정합니다.
      2. 고정된 마우스는 머리를 아래로 향하게 합니다.
      3. 준비된 면역원 용액 100μL를 하복강의 오른쪽 또는 왼쪽 사분면에 주입합니다.
2. 예방 접종 2주 후에 안구 표면 챌린지를 수행합니다.
   1. 이소플루란(2.5%)으로 마우스를 마취합니다.
   2. 양쪽 눈에 한쪽 눈당 5μL의 OVA(50mg/mL) 또는 식염수(0.9% NaCl)를 바르고 방울이 눈에 흡수될 때까지 기다립니다. ~5분 정도 소요됩니다.
   3. 7일 동안 매일 1회씩 절차를 반복합니다.
      메모: 약물의 국소 투여는 같은 방식으로 수행 할 수 있습니다.

2. 안삼출물 수집

1. 챌린지 직후 50μL의 멸균 식염수를 눈에 도포하여 챌린지 단계에서 형성된 안구 삼출물을 회수합니다.

3. 안구 표면 조직의 절제

1. 아래 단계에 따라 눈꺼풀과 안구를 해부합니다.
   1. CO₂ 질식 및 자궁 경부 탈구로 마우스를 안락사시킵니다.
   2. 평평한 표면에 마우스를 놓습니다.
   3. 70% 에탄올이 함침된 면봉으로 눈 주위의 안와 부위를 소독합니다.
   4. 귀와 후안와동 사이, 편평골 위의 표면을 따라 수직으로 절개하고, 아래 눈꺼풀 아래에서 상악골을 따라 수평으로 절개하고 상악골을 따라 위 눈꺼풀 위로 절개 부위를 확장합니다. 이것은 눈 주위를 절개합니다(그림 1).
   5. 절개된 눈 주위 조직을 구부러진 집게를 사용하여 조심스럽게 잡고 조직과 안구를 당겨 빼냅니다.
   6. 절제된 장기를 멸균된 PBS에 넣습니다.
   7. 절제된 윗 눈꺼풀 주위의 여분의 얼굴 근육 조직을 메스와 실체 현미경 아래에서 다듬습니다.
2. 아래 단계에 따라 결막을 수집합니다.
   1. 위 눈꺼풀을 실체 현미경 아래의 마른 페트리 접시에 놓습니다.
   2. 가는 핀셋과 메스를 사용하여 눈꺼풀 안쪽 표면에서 희끄무레한 점막층을 아주 부드럽게 벗겨냅니다.
3. 그런 다음 아래 단계에 따라 각막을 절개합니다.
   1. 드라이 아이스 위에 있는 새 드라이 페트리 접시에 안구를 3분 동안 놓습니다.
   2. 페트리 접시를 안정된 위치에서 벤치 표면에 가져갑니다.
   3. 가늘고 날카로운 가위를 사용하여 변연 옆의 각막 경계를 작게 절개합니다.
   4. 메스로 안구 주위를 길게 절개하여 공막과 각막을 분리합니다.
   5. 각막 뒤쪽에서 홍채와 수정체의 잔여물을 식염수로 넉넉하게 씻어내어 제거합니다.

결과

그림 1: 안와 영역을 둘러싼 안면 조직의 절제.절개 트레일은 빨간색으로 표시됩니다. 이를 통해 안구 기관을 절제하고 결막 및 각막과 같은 부속 안구 장기에 대한 다양한 국소 투여 치료제의 영향과 효과를 조사할 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
PBS 1개	지브코
수산화알루미늄	Imject alum Adjuvant	77161	40 mg/mL 최종 농도 : 생체 내 : 1 mg / 100 μL
C57Bl/6 마우스, 7-9주	찰스 리버 연구소
곡선형 집게	FST by Dumont 스위스	5/45 11251-35
가늘고 날카로운 가위	FST 스테인리스 스틸, 독일	15001-08
층류 안전 캐비닛	헤라세이프
NaCl 0.9%(식염수)	B.브라운
오브알부민(OVA)	엔도핏, 인비보젠	9006-59-1	10 mg/200 μL 식염수 중
백일해 독소	써모피셔 사이언티픽	PHZ1174	50 μg/ 500 μL 식염수 최종 농도 : 생체 내 : 100 μg / 100 μL
페트리디쉬	그라이너 바이오 원	628160
메스	깃털 일회용 메스	21위	최종 농도 : 생체 내 : 300 ng / 100 μL
실체현미경	자이스	스테미508
주사기(각막/홍채 세척)	BD 마이크로레인	27 G x 3/4 - Nr.20 0,4 x 19 밀리미터
주사기(i.p 면역)	BD 마이크로레인	24 G1"-Nr 17, 055* 25mm