강한 TCR 신호에 대한 흉선세포 반응을 조절하는 키나아제 억제제 식별

초록

출처: Chen, E. W., et al. 화학적 억제제 라이브러리의 스크리닝을 통한 T 세포 수용체 신호 전달의 매개체 식별. J. Vis. 특급 (2019).

이 비디오에서는 자가 반응성 CD4⁺CD8⁺ 이중 양성 미성숙 흉선세포의 세포사멸을 조절하는 저분자 키나아제 억제제를 식별하는 방법을 설명합니다. 세포사멸은 항-CD3 및 항-CD28 코팅된 자성 비드로 이중 양성 흉선세포를 활성화하여 유도됩니다. 그 다음에는 저분자 억제제 처리 및 유세포 분석 분석을 통해 억제제가 apoptotic marker 발현을 조절하는지 여부를 검출합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. Kinase Inhibitor Library Screening(원심분리기 독립 분석)

1. kinase inhibitors를 이용한 thymocyte의 치료
   1. 흉선세포 현탁액을 준비합니다.
   2. 흉선세포를 완전한 RPMI로 희석하여 25 x 10⁶ cells/mL의 흉선세포 현탁액을 얻습니다.
   3. 멀티채널 피펫을 사용하여 40μL의 흉선세포를 소량 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 접시를 얼음 위에 놓습니다.
   4. 억제제/DMSO/덱사메타손의 1부에 대한 완전 RPMI의 4부의 비율로 스톡 플레이트, DMSO 및 덱사메타손의 억제제를 완전한 RPMI로 희석합니다(5의 희석 인자).
      메모: 이 소량 플레이트에 사용된 부피가 기존 방법보다 5배 작기 때문에 억제제와 대조 시약은 플레이트의 흉선세포에 첨가하기 전에 5배 희석됩니다.
   5. 1.1.4단계에서 준비한 억제제 플레이트의 해당 웰에서 96웰 플레이트에 0.5μL의 키나아제 억제제를 추가합니다.
   6. 처리되지 않은 대조군의 8개의 웰을 준비합니다. 1.1.4단계에서 준비한 DMSO 0.5μL를 첨가하여 차량 처리 대조군 4웰을 준비합니다. 1.1.4단계에서 준비한 희석된 덱사메타손을 사용하여 5μM 덱사메타손 처리 대조군 4웰을 준비합니다(그림 1).

2. anti-CD3/CD28 beads를 이용한 thymocyte의 자극

1. 구슬이 균일하게 다시 매달려 있는지 확인합니다. 구슬 1mL를 PBS 2mL로 씻으십시오. 마그네틱 스탠드를 사용하여 비드를 분리하고 용액을 흡인합니다. 비드를 1mL의 완전한 RPMI.
   에 재현탁합니다. 메모: 세포에 대한 비드의 비율은 1 대 2.5입니다. 자극할 웰의 수와 사용된 흉선세포의 수에 따라 비드의 양을 조정하십시오.
2. 각 억제제 처리 샘플, DMSO 처리된 4개의 샘플, 8개의 처리되지 않은 샘플 중 4개에 10μL의 비드 현탁액을 추가합니다. 10μL의 완전한 RPMI를 처리되지 않은 나머지 4개의 웰에 추가합니다. 그림 1은 일반적인 플레이트 레이아웃을 보여줍니다.
   메모: 웰의 최종 부피는 50μL이며, 이는 웰의 최대 용량 내에 있습니다. 크로스 웰 유출을 방지하기 위해 주의를 기울이고 플레이트를 똑바로 세우는 것이 중요합니다.
3. 혼합하려면 마이크로플레이트 오비탈 셰이커를 사용하여 플레이트를 교반합니다. 또는 멀티채널 피펫을 사용하여 웰의 내용물을 혼합합니다.
4. 증발 방지 뚜껑을 사용하여 37 °C, 5% CO₂ 인큐베이터에서 17 - 20시간(또는 밤새) 동안 흉선세포를 배양합니다.

3. 플레이트 와셔 설정

참고: 플레이트 와셔 설정 지침은 제조업체에서 제공합니다. 단계는 아래에 간략하게 언급되어 있습니다. 각 프라이밍 단계에는 약 150mL의 용액이 필요합니다.

1. 1% Tween 20을 함유한 70% 에탄올로 세척 시스템을 프라임합니다.
2. 1% Tween 20을 함유한 탈이온수로 세척 시스템을 프라임합니다.
3. FACS 세척 버퍼로 세척 시스템을 프라임합니다.

4. 표면 항원의 염색

1. 항-TCRβ, 항-CD4, 항-CD8 및 항-CD69 항체를 함유하는 항체 염색 혼합물을 제조합니다. FACS 세척 완충액의 항체를 1:100(v/v)의 비율로 희석합니다.
2. 자동 층류 세척 시스템을 사용하여 세척당 55μL의 FACS 세척 버퍼를 사용하여 플레이트를 9회 세척합니다.
   메모: 세척이 끝나면 각 웰에 25μL의 잔류 부피가 생깁니다.
3. 1.4.1단계에서 준비한 염색 항체 혼합물 25μL에 세포를 재현탁합니다.
4. 샘플이 96-well 플레이트에서 옮겨진 경우, 항체 혼합물 50μL에 세포를 재현탁시키고 샘플을 소량 플레이트로 옮깁니다. 이 단계는 그림 2A에 표시된 것처럼 방법 번호 2에 해당합니다.
5. 혼합하려면 마이크로플레이트 오비탈 셰이커로 플레이트를 교반하거나 멀티채널 피펫을 사용하여 샘플을 혼합하고 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다.

5. 세포의 정착

1. 자동 층류 세척 시스템을 사용하여 세척당 55μL의 FACS 세척 버퍼를 사용하여 플레이트를 9회 세척합니다.
2. 웰당 50μL에서 고정/투과화 완충액(활성 caspase-3 apoptosis 키트와 함께 제공됨, 1.6.1단계에서 언급한 10x perm/wash 완충액 및 1.6.2단계에서 항-caspase-3 항체와 동일)을 추가합니다.
3. 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다.

6. 활성 카스파아제를 위한 세포 내 염색 3

1. 1x 퍼마/워시 버퍼 25mL를 초순수 225mL에 희석하여 1x 퍼마/워시 버퍼를 준비합니다.
2. 1x perm/wash buffer의 2mL에 anti-caspase-3 항체 1mL를 추가하여 세포 내 활성 caspase 염색을 준비합니다. 파마/세척 완충액에 대한 항체의 비율은 1:2입니다.
3. 1x 펌/워시 버퍼로 세척 시스템을 프라임합니다.
4. 1x perm/wash buffer로 플레이트를 9x 세척하며, 각 세척에 대해 55 μL로 세척합니다.
5. 1.6.2단계에서 준비한 세포 내 카스파아제 염색 25μL를 모든 웰에 추가합니다.
6. 혼합하려면 마이크로플레이트 오비탈 셰이커로 플레이트를 교반하거나 멀티채널 피펫을 사용하여 샘플을 혼합하고 얼음 위에서 1시간 동안 배양합니다.
7. 1x perm/wash buffer로 플레이트를 9x 세척하며, 각 세척에 대해 55 μL로 세척합니다.
8. 모든 웰에 25μL의 FACS 세척 버퍼를 추가합니다.
9. 피펫팅을 통해 적절한 혼합 후 샘플을 microtiter 튜브로 옮깁니다.
10. 빈 웰에 50μL의 FACS 세척 버퍼를 더 추가하고 1.6.9단계를 반복합니다.
11. 200μL의 샘플이 마이크로타이터 튜브에 수집될 때까지 1.6.9 및 1.6.10 단계를 2x 반복합니다.
    메모: 1.6.10 및 1.6.11 단계에서 설명한 절차의 목적은 소량 플레이트에서 세포를 최대한 회수하는 것입니다. 세포 수가 문제가 되지 않는 경우 1.6.10단계 후 FACS 세척 버퍼를 사용하여 microtiter 튜브를 200μL로 보충하기만 하면 됩니다.
12. 샘플의 유세포 분석을 실행하고 FACS 분석 프로그램으로 결과를 분석합니다. Caspase-3 활성화 및 CD69 발현은 CD4+CD8+DP 흉선세포를 포함하는 게이트에서 분석됩니다.

결과

그림 1: 흉선세포 활성화 분석법의 플레이트 레이아웃. (맨 위) 1열과 12열은 대조군용으로 예약되어 있고 2열에서 11열은 억제제 처리된 샘플(베이지색)입니다. 음성 대조군(비자극[NS], 회색)은 A1 - D1 웰을 차지하고, 세포 사멸에 대한 양성 대조군(덱사메타손 처리[DEX], 자주색)은 E1 - H1 웰을 차지합니다. 2열에서 12열에는 항-CD3/CD28 비드로 자극된 흉선세포가 포함되어 있습니다. 흉선세포 활성화를 위한 양성 대조군(자극된 샘플[α-CD3/CD28]; 녹색)은 A12 - D12 웰을 차지하고, 차량 제어(자극 및 DMSO 처리된 [α-CD3/CD28 + DMSO]; 빨간색)는 E12 - H12 웰을 차지합니다. (아래) 이중 양성(DP) 게이트 내에서 개폐된 흉선세포의 활성 카스파제-3(ActCasp3), CD69 및 TCRβ 염색에 대한 유세포...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
RPMI	하이클론	SH30027FS
FBS(증권 시세	하이클론	SH3007103
L-글루타민	하이클론	SH3003401
나트륨 피루브산	하이클론	SH3023901
10X PBS	비반티스	PB0344 – 1L
Kinase 스크리닝 라이브러리(96-well)	케이맨 화학	10505	라이브러리의 정확한 내용은 다를 수 있습니다
디엠소	시그마 알드리치	D2650
덱사메타손	시그마 알드리치	D4902
안티 CD3/CD28 비드	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	11452D
FITC 액티브 카스파제-3 세포사멸 키트	BD 파밍겐	550480	Fixation/Permeabilization buffer, 10X Perm/Wash buffer 및 anti-caspase 3 항체 포함
DA-셀 와셔	큐리옥스	HT1000
96웰 DA-셀 플레이트	큐리옥스	96-직류-CL-05
항 체
CD3e를 참조하십시오.	바이오레전드	100236
TCRb	BD 바이오사이언스	553174
CD4	BD 바이오사이언스	740007
CD8	BD 바이오사이언스	563786
CD69 (영어	이바이오사이언스	Tel.: 25-0699-42
억제제
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파클리탁셀	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
엘로티닙	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
네크로스타틴-5	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
네비-베즈235	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
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룩소리티닙	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
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게피티닙	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
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인디루빈-3'-모노심	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
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KN-93	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
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이소-올로무신	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
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Bisindolylmaleimide VIII (아세테이트)	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
ST638	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
SU 6656	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
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SB 203580 (염산염)	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
CAY10621	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
YM-201636	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
ZM 447439	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
AS-041164	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
NVP-AEW541 (염산염)	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
PP242	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
869	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
CAY10622	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
17β-하이드록시 워트만닌	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
CAY10626	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
SU 6668	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
CAY10572	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
N,N-디메틸스핑고신	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
LY294002	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
U-0126	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
스타우로스포린	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
KN-92 (염산염)	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
AS-605240(칼륨염)	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
O-1918	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
Y-27632 (염산염)	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
릴라민	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
PD 98059	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
PD 169316	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
-221	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
(S)-H-1152(염산염)	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
AS-605240	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
D-에리스로-스핑고신 C-18	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
OSU03012	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
JNJ-10198409	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
릴아민(염산염)	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
아라키돈산 릴아미드	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
라우르산 릴아미드	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
AS-252424	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
CAY10505	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
파이-103	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
PIK-75 (염산염)	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
스핑고신 키나아제 억제제 2	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
피케아탄놀	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
사우스캐롤라이나-1	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
(R)-로스코비틴	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
베이-43-9006	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
CAY10561	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
AS-604850	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
PI3-Kinase α 억제제 2	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
ML-9	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
트리시리빈	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
에르브스타틴 아날로그	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
켄폴론	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
올로무신(Olomoucine	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
AG-494	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
AG-825	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
AG-1478	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
SB 216763	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
SB 415286	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
아그-17	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
H-8 (염산염)	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
LFM-A13	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
사우스 캐롤라이나-514	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
아피제닌	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
아그-18	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
CAY10554	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
증권 시세	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
RG-13022	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
RG-14620	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
AG-490	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
아그-82	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
아그-99	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
아그-213	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
AG-183	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
라벤더스틴 C	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
ZM 336372	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
5-요오도투베르시딘	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
SB 202190	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
CAY10571	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
닐로티닙	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
스태프 600125	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
L-스레오-스핑고신 C-18	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
H-89	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
HA-1077 (염산염)	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
아그-370	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
워트마닌	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
AG-1296	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
KT 5823	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
자넥스 1	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
CAY10574	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
CAY10575	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
CAY10576	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
NH125	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
TWS119	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
NSC 210902	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
CAY10577	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
CAY10578	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
PD 184161	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
CCT018159	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library
미리세틴	케이맨 화학	-	출처: Kinase Screening Library

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