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동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. 항체를 이용한 골수 대식세포 유도 및 활성화
- CO2 질식을 사용하여 안락사를 수행합니다.
- 마우스를 유도 챔버에 놓습니다. 5% 이소플루란 마취로 마우스를 60 - 90초 동안 움직이지 못하고 호흡이 깊고 느려질 때까지 안락사시킵니다.
- 이소플루란 마취를 끄고 마우스가 호흡을 멈출 때까지 6 - 8 L/min의 CO2를 투여합니다. CO 2를 켠 상태로 마우스를 최소5분 동안 그대로 두십시오. 더 이상 심장 박동이나 호흡이 없는지 확인합니다. 죽음을 보장하기 위해 경추 탈구를 수행합니다.
참고: 8-12주 된 마우스는 가장 높은 대식세포 수율을 제공합니다.
- 마우스 다리에 70% 에탄올을 뿌리고 폼 보드 위에 누운 자세로 팔과 다리를 쭉 뻗어 고정합니다. 피부를 잡기 위해 가위와 집게로 얕게 자른 (0.2cm) 뒷다리 표면의 피부와 털을 제거합니다.
메모: 이 절차와 모든 조직 배양 조작을 멸균 후드에서 수행합니다.
- 경골과 대퇴골이 보이도록 근육을 다듬습니다. 고관절 바로 아래와 발목 위의 뼈와 근육을 잘라 경골과 대퇴골을 제거합니다. 가능한 한 많은 근육을 잘라냅니다.
- 뼈에 70% 에탄올을 분사하고 증발할 때까지 1분 동안 기다린 다음 뼈 플러시 배지(Iscove의 변형된 Dulbecco's 배지(IMDM), 10% 소 태아 혈청(FBS))의 6웰 플레이트에 놓습니다.
- 골강이 드러나도록 발목과 대퇴골 위쪽에서 0.1cm의 뼈를 잘라 뼈 끝을 다듬습니다. 골수가 보이는지 확인하고 26게이지 바늘을 골강에 넣을 수 있는지 확인합니다.
- 뼈와 근육을 잘라 무릎 관절에서 경골과 대퇴골을 분리합니다. 10mL 주사기에 부착된 26게이지 바늘을 캐비티에 삽입합니다. 골수를 5mL의 뼈 플러시 배지가 있는 50mL 원뿔형 튜브에 플러시합니다. 한 마리의 마우스에서 두 개의 경골과 두 개의 대퇴골을 각 50mL 튜브에 플러시합니다.
- 피펫을 위아래로 여러 번 사용하거나 느린 속도로 골수를 소용돌이치게 하여 덩어리를 부드럽게 분산시킵니다. 골수 줄은 작은(0.5mm 미만) 골수 반점으로 분해해야 합니다. 뼈 플러시 매체로 원뿔형 튜브를 50mL까지 채웁니다. 원뿔형 튜브의 내용물을 75cm2 조직 배양 처리된 플라스크에 피펫으로 넣고 37°C, 5% CO2에서 1시간 동안 배양합니다.
메모: 성숙한 대식세포와 중간엽 세포는 플라스크에 부착되어 폐기되는 반면, 원하는 조혈 전구세포는 현탁 상태로 남아 있습니다.
- 조혈전구세포가 있는 배지를 50mL 원추형 튜브에 피펫으로 넣습니다. 튜브를 300 x g의 실온에서 5분 동안 원심분리합니다. 상등액을 버리고 펠렛을 5mL의 대식세포 집락자극인자(MCSF) 배양 배지(IMDM, 10% FBS, 5ng/mL MCSF, 100U/mL 페니실린/스트렙토마이신 및 150μM 모노티오글리세롤(MTG))에 재현탁합니다.
- 혈구계를 사용하여 세포를 계산합니다. 배지 30mL에 0.5 x 106 cells/mL, 1.5 x 107 cells/flask 농도로 세포를 재현탁시키는 배지를 추가하고 부드럽게 위아래로 피펫팅합니다. 현탁액 30mL를 새로운 75cm2 조직 배양 처리된 플라스크에 피펫으로 넣습니다.
- 1.9단계에서 초기 배양 후 4일차와 7일차에 반전 위상차 명시야 현미경을 사용하여 세포가 부착되어 있고 약간 분지되어 있는지 확인합니다. 비부착성 세포를 포함하는 배지를 폐기합니다. IMDM으로 세포를 한 번 세척하고 MCSF 배양 배지 30mL를 첨가합니다.
- 세포가 10일째까지 성숙하면(F4/80 및 Mac-1에 대해 >95% 양성) 세포가 약간 부착되어 있는지 다시 확인합니다.
- 자극을 위해 세포를 플레이트링하려면 플라스크에서 배양 배지를 제거하고 효소가 없는 EDTA 기반 세포 해리 완충액 8mL를 추가합니다(재료 표). 37 ° C, 5 % CO2에서 5 분 동안 세포를 배양합니다.
- 멸균 세포 스크레이퍼를 사용하여 소량의 압력으로 세포를 부드럽게 긁어냅니다. 현미경으로 세포가 플라스크 표면에서 분리되었는지 확인합니다. 피펫은 세포를 50mL 원뿔형 튜브로 해리했습니다. 플라스크를 5mL의 IMDM으로 3회 헹구고 헹굼 용액을 수확한 세포와 함께 모읍니다. 300 x g의 원심분리기 셀, 실온에서 5분간
- 50mL 코니컬 튜브당 3mL의 MCSF 배양 배지에 세포 펠렛을 재현탁합니다. 혈구계를 사용하여 생존 가능한 세포를 계수합니다. 1 x 106 cells/mL의 농도로 세포를 재현탁하고 처리된 96-well 조직 배양 웰당 100 μL의 세포 현탁액(1 x 105 cells/well)을 플레이트화하고 바닥을 평평하게 만듭니다.
메모: 한 마리의 쥐에서 나온 뼈는 100웰에 충분한 세포를 생성합니다. 원하는 경우 1mL의 세포를 6웰 플레이트(조직 배양 처리, 바닥이 평평함)에 도말할 수 있습니다. 더 많은 수의 세포(1 x 10,6 세포)가 웨스턴 블롯 분석에 유용할 수 있습니다.
- 일단 부착되면 IMDM에서 10ng/mL의 LPS, 30mg/mL의 IVIg 또는 IVIg + LPS로 각각 복제 또는 삼중 웰을 자극합니다. 반응을 최적화하기 위해 LPS 또는 IVIg의 용량을 적정할 수 있습니다. 중복 또는 삼중 우물은 자극되지 않은 대조군으로 둡니다. 24 시간 (37 °C, 5 % CO2) 동안 배양하십시오 .
메모: 재도금된 세포는 1시간 이내에 조직 배양 웰에 부착되어야 합니다.
- 각 웰의 세포 상등액을 개별 1.7mL 마이크로 원심분리 튜브에 모으고 10,000 x g에서 5분 동안 회전하여 미립자 물질을 제거합니다.
- 세포 상등액을 제거하고 펠릿을 방해하지 마십시오. 정화된 세포 상등액을 멸균 마이크로 원심분리기 튜브에 넣습니다.
메모: 세포 상등액은 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)을 통해 사이토카인, IL-10 및 사이토카인 소단위체, IL-12/23p40에 대해 즉시 분석하거나 -80°C에서 장기간 보관할 수 있습니다. 시중에서 판매되는 키트(Table of Materials)의 ELISA 프로토콜을 따릅니다. IL-6 및 TNF와 같은 다른 전염증성 사이토카인은 LPS 단독 자극에 비해 IVIg + LPS 자극과 병용하여 감소하기 때문에 분석할 수 있습니다. 자극 후, 부착 세포는 웨스턴 블로팅(western blotting) 또는 정량적 중합효소 연쇄 반응(Q-PCR)과 같은 기술에 대비할 수 있습니다.