쥐 모델에서 항체에 반응하여 복막 대식세포의 생체 내 활성화(In vivo Activation of peritoneal macrophages in response to antibodies in a murine model)

초록

출처: Kozicky, L., et al., 쥐 골수 및 복막 대식세포 활성화에 대한 항체 기반 약물 효과 평가.J. Vis. 특급 (2017)

이 비디오는 정맥 면역글로불린과 박테리아 지질다당류를 사용하여 마우스의 복막 대식세포를 활성화하는 방법을 보여줍니다. 동시 자극은 복막 대식세포를 면역 조절 활성을 가진 항염증 대식세포로 활성화합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 면역글로불린 및 지질다당류(IVIg+LPS) 정맥 주사를 이용한 생체 내 마우스 도전 및 복막 대식세포 수확

1. 각 마우스의 무게를 잰다. 체중 2.5g/kg의 최종 투여량을 제공하는 데 필요한 IVIg(100mg/mL 스톡 농도)의 부피를 계산합니다. 0.2μg/g 체중의 최종 용량을 제공하는 데 필요한 LPS(Iscove의 변형된 Dulbecco's 배지(IMDM)의 100μg/mL 스톡 농도)의 양을 계산합니다.
   메모: 예를 들어, 20g 마우스의 경우 500μL의 IVIg 원액과 40μL의 LPS 100μg/mL 용액이 필요합니다.
2. 멸균 26게이지 바늘이 장착된 멸균 1mL 주사기에 필요한 양의 IVIg 및 LPS를 뽑습니다. IVIg를 투여받지 않는 대조군 마우스의 경우, 동일한 부피의 IVIg를 멸균 인산염 완충 식염수(PBS) pH 7.4로 교체하십시오.
3. 엄지와 검지로 쥐의 목 뒤쪽 피부를 잡고 남은 손가락으로 꼬리와 뒷다리를 잡고 한 손으로 쥐를 긁습니다. 몸을 땅 쪽으로 기울입니다.
4. 바늘을 마우스의 복부를 기준으로 30 - 40° 각도로 오른쪽 하단 사분면에 놓고 비스듬하게 한 다음 1.5cm 삽입합니다. IVIg + LPS 또는 PBS + LPS를 복강내로 주입합니다.
5. 1시간 후 이산화탄소(CO₂) 질식을 이용한 안락사를 시행합니다.
   1. 마우스를 유도 챔버에 놓습니다. 5% 이소플루란 마취로 마우스를 60 - 90초 동안 움직이지 못하고 호흡이 깊고 느려질 때까지 안락사시킵니다.
   2. 이소플루란 마취를 끄고 마우스가 호흡을 멈출 때까지 6-8L/min의 CO₂를 투여합니다. CO 2를 켠 상태로 마우스를 최소₅분 동안 그대로 두십시오. 더 이상 심장 박동이나 호흡이 없는지 확인합니다. 죽음을 보장하기 위해 경추 탈구를 수행합니다.
      참고: 8-12주 된 마우스는 가장 높은 대식세포 수율을 제공합니다.
6. 팔다리를 벌리고 마우스를 폼 보드에 고정합니다. 부품에 70% 에탄올을 뿌립니다.
   메모: 멸균 후드에서 절차를 수행하십시오.
7. 복막강이 절단되지 않도록 마우스의 정중선을 따라 가위로 피부(0.2cm)를 얕게 자릅니다. 집게를 사용하여 마우스의 배에서 복부 피부를 당겨 손상되지 않은 복막 벽의 내벽이 보이
도록 합니다.
8. 5mL 주사기에 5mL의 멸균 PBS(pH 7.4)를 채웁니다. 바늘의 경사가 위로 향하게 하여 왼쪽 또는 오른쪽에서 마우스 중앙을 향해 캐비티 상단에 25 또는 27 게이지 바늘을 삽입합니다.
   메모: PBS를 장기에 주입하지 않고 복막 공간에 주입하도록 바늘을 마우스에 조심스럽게 놓습니다.
9. 액체를 복막강으로 밀어 넣습니다. 구멍에서 바늘을 빼내고 복막을 10초 동안 마사지하여 세포를 제거합니다. 구멍 상단에 바늘을 삽입하고 장기를 피하십시오. 회수된 세척액을 모아 15mL 원추형 튜브에 넣고 얼음 위에 놓습니다.
   메모: 주입된 유체 5mL당 약 3.75mL가 회수됩니다.
10. 주입 및 회복(1.8 - 1.9단계)을 3회 더 반복하여(총 주입량 20mL) 총 15mL의 세척액을 회수합니다. 각 마우스의 세척을 별도의 15mL 원뿔형 튜브에 모읍니다.
    메모: 최종 주입 후에는 액체가 축적된 마우스의 맨 왼쪽과 오른쪽에서 액체를 추출하는 것이 더 쉬울 수 있습니다. 장기는 이 위치에서 바늘에 간섭을 덜 일으킵니다.
11. 4°C에서 5분 동안 300 x g에서 세포를 스핀다운합니다. 회수된 세척액 1mL를 제거하고 제조업체의 지침에 따라 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)을 통한 인터류킨 또는 IL-10 및 IL-12/23p40 분석에 사용하거나 향후 분석을 위해 -80°C에서 동결합니다.
    메모: 세척액 사이토카인 분석을 위한 처리 간의 정확한 비교를 위해 최종 부피 15mL에 대해 복막강을 5mL 플러시 4회 수행합니다. 각 플러시에서 모든 유체가 회수되는 것은 아닙니다.
12. 플러시된 마우스 한 마리당 500μL의 도금 배지(IMDM, 10% 소 태아 혈청, FBS 및 100U/mL 페니실린/스트렙토마이신)에 세포를 재현탁합니다. 생존 가능한 대식세포를 세십시오.
    메모: 대식세포는 다른 복막 세포보다 약간 큽니다. 일반적인 수율은 야생형 C57BL/6 마우스를 사용하는 마우스당 5 x 10⁵ - 1 x 10⁶ 대식세포입니다.
    선택적: 세포 펠릿에 많은 수의 적혈구가 존재하는 경우 제조업체의 지침에 따라 적혈구 단계를 수행하여 제거하십시오.
13. 1 x 10⁶ 대식세포/mL의 도금 배지에 세포를 재현탁하고 96웰 평평한 바닥 조직 배양 처리된 플레이트에서 웰당 100μL를 플레이트화합니다.
    메모: 실험을 위해 둘 이상의 마우스에서 세포를 풀링해야 할 수도 있습니다. 예를 들어, 한 마우스에 5 x 10⁵ 대식세포가 있는 경우 500μL의 도금 배지가 필요합니다.
14. 대식세포가 부착될 수 있도록 37°C, 5% CO₂에서 1시간 동안 세포를 배양합니다. 부착 세포는 복막 대식세포(peritoneal macrophage)입니다. 세포 상층액 및 비부착성 세포를 제거합니다. 200μL IMDM(37°C로 예열)으로 웰을 두 번 헹구고 10초 동안 기다린 다음 플레이트를 천천히 기울입니다. 도금 매체를 교체하십시오. 자극 전 30분 동안 37°C, 5% CO₂에서 세포를 배양합니다.
15. 일단 부착되면 IMDM에서 10ng/mL의 LPS, 30mg/mL의 IVIg 또는 IVIg+LPS로 각각 복제 또는 삼중 웰을 자극합니다. 반응을 최적화하기 위해 LPS 또는 IVIg의 용량을 적정할 수 있습니다. 중복 또는 삼중 우물은 자극되지 않은 대조군으로 둡니다. 24 시간 (37 °C, 5 % CO₂) 동안 배양하십시오 .
    메모: 재도금된 세포는 1시간 이내에 조직 배양 웰에 부착되어야 합니다. 샘플은 즉시 사용하거나 ELISA에 의한 사이토카인 분석을 위해 -80°C에서 냉동 및 보관할 수 있습니다.
16. 각 웰의 세포 상등액을 개별 1.7mL 마이크로 원심분리 튜브에 모으고 10,000 x g에서 5분 동안 회전하여 미립자 물질을 제거합니다.
17. 세포 상등액을 제거하고 펠릿을 방해하지 마십시오. 정화된 세포 상등액을 멸균 마이크로 원심분리기 튜브에 넣습니다.
    메모: 세포 상등액은 ELISA에 의해 사이토카인, IL-10 및 사이토카인 소단위체, IL-12/23p40에 대해 즉시 분석하거나 -80°C에서 장기간 보관할 수 있습니다. 시중에서 판매되는 키트(Table of Materials)의 ELISA 프로토콜을 따릅니다. IL-6 및 종양괴사인자(TNF)와 같은 다른 전염증성 사이토카인도 LPS만 사용한 자극에 비해 IVIg+LPS 자극과 병용하여 감소하기 때문에 분석할 수 있습니다. 자극 후, 부착 세포는 웨스턴 블로팅(western blotting) 또는 정량적 중합효소 연쇄 반응(Q-PCR)과 같은 기술에 대비할 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Iscove의 변형된 Dulbecco의 매체(IMDM)	생명 기술	12440053
소 태아 세럼(FBS)	생명 기술	제12483-020
페니실린-스트렙토마이신	생명 기술	15140148
1X 적혈구 용해 완충액	이바이오사이언스
세포 해리 완충액	생명 기술	13150016	효소 무함유, Hanks 기반, EDTA
지방다당류(LPS)	시그마 알드리치	패 4516	대장균 0127:B8에서
IVIg(감무넥스)	그리폴스	BC 아동병원, 수혈의학과로부터 받음
IVIg(감마가드 액체)	박스터 헬스케어 코퍼레이션	BC 아동병원, 수혈의학과로부터 받음
IVIg(옥타감)	옥타파마	BC 아동병원, 수혈의학과로부터 받음
인산염 완충 식염수(PBS)(멸균), pH 7.4	생명 기술	10010023
마우스 IL-10 ELISA	BD 생명과학	555252
마우스 IL-12/23p40 ELISA	BD 생명과학	555165
바늘 26g	BD 생명과학	제305110
1mL 주사기	BD 생명과학	309659
10mL 주사기	BD 생명과학	309604
15mL 코니컬 튜브	BD 생명과학	352096
집게	폭스바겐	82027-386	미세한 팁, 해부
가위	폭스바겐	82027-582	섬세한, 4 1/2"
명시야 현미경	모틱	AE31	반전된 위상차
저울	메틀러	PE 3000

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