마우스 모델에서 박테리아 감염에 대한 백신 유도 면역 평가

초록

출처: Caution, K., et al. 마우스의 숙주-병원체 반응 및 백신 효능 평가. J. Vis. 특급 (2019).

이 비디오에서는 생쥐의 Bordetella 백일해 감염에 대한 무세포 백일해 백신의 효능을 테스트하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 백신 접종 후, 생쥐는 감염을 겪었고, 생쥐의 조직 균질액을 배양하여 박테리아 군체를 분석하여 백신으로 인한 보호 면역을 판독했습니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 마우스의 면역

1. 식염수 또는 DPS.
   와 같은 멸균 생리학적 완충액에서 마스터 백신 혼합물을 준비합니다. 메모: 혼합물의 총 부피는 전체 그룹의 예방 접종에 필요한 것보다 10% 더 많이 포함되어야 합니다. 백신 조성의 농도는 아래 1.1.1 및 1.1.2 단계에 자세히 설명되어 있습니다. 얼음 위의 비바리움으로 물건을 운반하십시오.
   1. B. 백일해 연구의 경우 무세포 백일해 백신(aPV) 및 aPV + 보르데텔라 집락화 인자 A(BcfA)와 같은 백신 그룹을 포함합니다. 또한 명반, 백신 항원 단독(사상혈구마글루티닌(FHA) 및 퍼탁틴(Prn)) 및 미숙(면역되지 않은) 마우스를 대조군으로 사용합니다.
      참고: aPV는 파상풍 톡소이드, 감소된 디프테리아 톡소이드, 백일해 톡소이드(PT), 필라멘트 헤마글루티닌(FHA) 및 알루미늄염에 흡착된 퍼크턴틴(Prn)으로 구성된 FDA 승인 aPV의 인간 복용량의 1/5입니다. 현재 백일해 aPV의 인간 1회 투여량은 0.5mL이므로 투여^{량의 1}/5은 0.1mL입니다. aPV + BcfA의 부피는 마우스당 aPV 0.1mL(인간^{용량의 1}/5) + BcfA 0.046mL(30μg)입니다. 1개의 근육에 안전하게 전달할 수 있는 최대 부피는 0.1mL입니다. aPV + BcfA 백신 부피가 0.1mL 이상이기 때문에 백신을 안전하게 투여하기 위해 양쪽 어깨에 거의 동일하게 나누어 전달해야 합니다.
   2. 실험용 백신을 준비하려면 1회 투여량으로 FHA 1μg 및 Prn 0.5μg을 멸균 PBS에 수산화알루미늄 겔 50μg과 결합합니다. 실험용 aPV가 실온(RT)에서 15분 동안 실험실 롤러에서 혼합되도록 합니다. 그 후, 튜브를 18,000 x g에서 4°C에서 5분 동안 회전시킵니다.상층액을 제거하고 1mL의 멸균 PBS에 내용물을 재현탁합니다.
2. 사육장에서 마취 기계를 설정합니다(그림 1).
   메모: 사용하기 전에 각각의 탱크에 적절한 수준의 산소와 이소플루란이 있는지 확인하십시오. 이소플루란 청소부 캐니스터의 무게를 측정하고 무게가 50g 증가하면 교체합니다.
3. 생물 안전 캐비닛(BSC)을 철저히 청소하고 깨끗한 유도 챔버를 BSC 내부에 놓습니다. 마취 기계의 마취 라인과 청소부 라인을 유도 챔버에 연결합니다. 조절기를 통해 산소 탱크를 열어 산소가 흐르고 있는지 확인하고 수준을 1.5-2L/min으로 설정합니다.
4. 원하는 연령(6-12주)의 마우스를 유도 챔버에 넣습니다. 마우스를 가볍게 마취하기 위해 이소플루란을 2.5-3%로 켭니다. 동물들이 챔버 안에서 움직이지 않고 호흡이 느려질 때까지 동물들을 모니터링하십시오.
5. 발가락을 꼬집어 유도 수준을 테스트하고 반사적인 움직임을 관찰합니다. 아무 것도 없으면 마우스가 주입할 준비가 된 것입니다.
   참고: 이 실험에서는 동물의 우리 전체를 한 번에 마취시켰다. 주사를 위해 동물을 개별적으로 마취하거나 마취 없이 동물을 주사하도록 선택할 수 있습니다. 이러한 방법 중 하나가 적절합니다.
6. 한편, 인슐린 주사기 1mL(28G1/2)와 백신 0.1mL를 각각 준비합니다. 동물이 완전히 유도되면 챔버에서 동물 한 마리를 꺼내 쥐를 수건이나 벤치 패드 위에 복부로 눕힙니다.
7. 백신을 근육 주사로 투여합니다. 주사기를 45° 각도로 놓고 베벨이 위를 향하게 하여 주사기를 마우스의 삼각근에 ~5mm 삽입하고 백신을 주입합니다.
   메모: 뒷부분/옆구리는 삼각근 대신 주사 부위로 사용할 수 있습니다.
8. 주사 후 바늘을 근육에 삽입한 상태를 ~5-10초 동안 유지하십시오. 부피가 전달되면 주사기를 180° 회전하여 베벨이 반대쪽을 향하도록 하여 밀봉을 만들고 백신의 누출을 방지합니다. 그런 다음 주사 부위에서 바늘을 천천히 당겨 빼냅니다.
9. 마우스를 케이지로 되돌립니다. 지정된 그룹의 모든 동물에 대해 절차를 반복합니다.
10. 이소플루란을 끄고 다음 생쥐 케이지를 마취하기 전에 유도 챔버를 산소로 씻어냅니다.
11. 동물들이 모두 경계하고 우리 안에서 움직일 때까지 동물을 모니터링하십시오. 케이지를 하우징 위치로 되돌립니다.
12. 백신 접종 후 12시간마다, 최대 48시간까지 동물을 모니터링하여 털이 거칠거나 지저분한 털, 느린 걸음걸이 또는 호흡 곤란과 같은 이환율의 임상 증상이 있는지 확인합니다. 증상이 지속되면 기관 수의사와 상의하고 필요한 경우 마우스를 연구에서 제외합니다.
13. 초기 면역 접종 4주 후, 이전에 투여한 것과 동일한 백신 제형으로 마우스의 오른쪽 삼각근에 마취 및 근육 주사를 투여하여 마우스를 강화합니다.
14. 다시 말하지만, 동물에게 임상 증상이 있는지 모니터링한다. 추가로 2주 동안 동물을 수용한 다음 감염을 진행하십시오.

2. 쥐 비강 내 감염 모델

1. 사육장에서 1.3단계와 1.4단계에 설명된 대로 산소 및 마취 상태를 설정합니다. 1.5단계에서 설명한 대로 마우스를 챔버에 넣어 마취합니다. 마취가 효과를 발휘할 때까지 동물을 모니터링하십시오.
2. 마우스가 마취되면 유도 챔버에서 한 번에 한 마리의 동물을 제거합니다. 견갑골과 목 뒤에 있는 등쪽 흉부의 목덜미를 잡고 마우스를 듭니다. 코에 접근하기 위해 마우스를 똑바로 놓습니다.
3. 200 μL 피펫 팁을 사용하여 B. pertussis bacterial inoculum 40-50 μL를 마우스의 콧구멍에 천천히 적용합니다(각 콧구멍에서 20-25 μL). 동물이 전체 접종물을 흡입할 때까지 마우스를 잡고 있습니다. 접종물 중 일부가 거품이 나면 거품을 모아 콧구멍에 다시 주입합니다. 한 그룹의 마우스에 동일한 양의 멸균 PBS를 음성 대조군으로 전달합니다.
4. 1.10-1.12단계에서와 같이 접종한 동물을 우리로 되돌리고 동물이 경계하고 움직일 때까지 모니터링합니다. 케이지를 랙의 원래 하우징 공간으로 되돌립니다. 다음 동물 세트를 마취하기 전에 잔류 이소플루란을 제거하기 위해 유도 챔버를 산소로 세척합니다. 감염 후 48시간 동안 동물을 모니터링합니다.
5. 실험실에서는 멸균 PBS에서 접종물의 플레이트 연속 희석을 통해 마우스에 전달되는 실제 집락 형성 단위(CFU)를 확인합니다. 10% BG + Sm 플레이트(10% 제세분된 양의 혈액과 100μg/mL 스트렙토마이신이 보충된 Bordet-Gengou 한천 플레이트)에 0.1mL의 희석액을 플레이트로 만듭니다(그림 2A). 플레이트를 37°C 인큐베이터에 넣고 4일 동안 성장시킵니다. 마우스에 전달된 접종물에서 CFU를 세고 계산합니다(그림 2B).

3. 감염 후 동물 조직 적출

1. 쥐 해부 및 조직 채취를 준비합니다.
   1. 오토클레이브에서 조직을 처리하는 데 필요한 모든 도구(굵고 가는 가위, 구부러진 가위, 가는 집게, 펠릿 유봉 및 삼각형 스프레더)를 살균합니다. 도구를 멸균 파우치에 밀봉하십시오. 유리 dounce 균질기를 호일로 감싸고 오토클레이브 테이프를 추가하여 무균 상태를 나타냅니다.
   2. 조직 적출 1일 또는 2일 전에 한천 플레이트를 준비하여 사용 전에 플레이트가 응고되었는지 확인하십시오. B. pertussis의 경우 10% BG + Sm을 사용합니다. 각 실험에 대해 경험적으로 결정된 원하는 희석액으로 각 마우스의 폐에 대한 라벨 플레이트를 사용합니다.
   3. CFU 희석 튜브를 채우고 라벨을 부착합니다. 처리할 장기 수와 장기당 희석량에 따라 멸균 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 0.9mL의 멸균 PBS를 추가합니다.
   4. 조직 채취를 위한 튜브 채우기 및 라벨링:
      1. 폐: PBS의 멸균 1% 카제인 2mL를 멸균 15mL 코니컬 튜브에 넣고 4°C에서 보관합니다. 조직학을 위해 폐를 채취하려면 10% 중성 완충 포르말린(NBF) 2mL를 첨가하고 RT에 보관하십시오.
   5. 신선한 70% 에탄올은 해부를 위해 비커와 스프레이 병을 채울 수 있도록 준비해야 합니다.
2. 수확 당일 모든 재료를 카트에 담아 사육장으로 운반하십시오. BSC를 세척하고 1.3 및 1.4 단계와 같이 마취 기계를 설정합니다.
3. 해부할 쥐를 유도 챔버에 놓고 산소가 흐르는 상태에서 이소플루란을 5%까지 켜고 동물이 의식을 잃을 때까지 기다립니다. 쥐를 한 번에 한 마리씩 제거하고 동물을 자궁 경부로 탈구시켜 죽음을 보장합니다. 자궁경부 탈구 후 안락사는 호흡수 부재 및/또는 금단 반사의 부재로 확인해야 합니다(발가락 꼬집음 테스트).
4. 복부 쪽이 위를 향하도록 마우스를 해부 보드에 놓고 팔과 다리를 핀으로 엽니다. 마우스 본체에 70% 에탄올을 뿌립니다.
5. 집게를 사용하여 복부 아래, 골반 중앙의 피부를 꽉 쥉니다. 날카로운 가위를 사용하여 하악골까지 수직으로 자릅니다. 그런 다음 가위를 닫은 상태에서 작은 동작을 사용하여 두 층을 밀어 복막벽에서 피부를 절개합니다. 피부를 사체 측면에 배치하여 무균 장기 적출을 위한 막히지 않은 밭을 만듭니다.
6. 집게를 사용하여 xiphoid 과정에서 흉곽을 고정하고 횡격막을 절단하여 엽니다. 폐는 수축되어 척추 쪽으로 떨어져야 합니다. 흉갑을 제거하기 위해 측면의 흉곽을 잘라냅니다.
7. 오른쪽 폐의 상엽을 분리하고 제거하여 폐동맥과 정맥을 절단합니다. 10% NBF가 포함된 15mL 원뿔형 튜브에 로브를 놓고 튜브를 최소 24시간 동안 RT에 놓아 조직을 고정합니다. 오른쪽 폐와 왼쪽 폐의 나머지 엽을 분리합니다. PBS에 2mL의 1% 카제인이 들어 있는 15mL 원뿔형 튜브에 엽을 넣고 얼음 위에 놓습니다.
8. 사체는 생물학적 위험 봉투에 넣어 폐기하십시오. 다음 동물을 해부하기 전에 탈이온수로 도구를 헹군 다음 70% 에탄올로 채워진 비커에 넣으십시오. 도구를 제거하고 과도한 에탄올을 털어낸 후 다음 해부를 진행하십시오.
9. 위에서 언급한 단계에 따라 각 마우스를 해부합니다.
10. 아래 설명된 대로 조직을 처리합니다.

4. 폐의 처리

1. 폐(PBS의 1% 카제인 2mL)를 멸균된 15mL Dounce 균질기로 옮깁니다. 유봉을 사용하여 조직을 균질화하십시오. 큰 조직 입자가 남지 않을 때까지 해리합니다. 균질화된 현탁액을 원래의 15mL 튜브에 다시 놓습니다.
2. CFU 도금을 위해 0.3mL 분취액을 제거하고 450 x g에서 4°C에서 5분 동안 균질액을 원심분리합니다. 0.5mL 분취액의 상등액을 수집하여 사전 라벨링된 마이크로 원심분리 튜브에 분취합니다. ELISA에 의한 사이토카인 분석이 완료될 때까지 -20°C에서 샘플을 보관하십시오.
3. 희석 튜브에서 균질화된 폐 현탁액 0.1mL(멸균 PBS 0.9mL)를 연속적으로 희석하여 선택한 희석액을 준비합니다. 경험적으로 선택된 희석액 0.1mL를 사전 라벨링된 10% BG + Sm 플레이트에 플레이트화하고 멸균 삼각형 스프레더를 사용하여 펴 바릅니다.
4. 플레이트를 37 ° C의 실내 공기에서 4 일 동안 배양합니다.
5. CFU/폐 계수 및 계산(그림 3). 간단히 말해서, 회수된 CFU 수에 플레이트의 희석 계수를 곱한 다음 장기가 처리된 총 부피를 곱합니다. 그런 다음 CFU 계산은 각 동물에 대한 Log₁₀ 값으로 변환되고 그래프로 표시됩니다.
   1. 30-300 콜로니가있는 플레이트는 쉽고 정확하게 계산됩니다. 6개 미만의 콜로니가 있는 플레이트는 이러한 낮은 콜로니 수로 인해 오류가 발생하므로 계산에 사용해서는 안 됩니다. 검출 하한을 얻기 위해, 장기가 균질화된 총 부피를 희석되지 않은 균질산염에서 플레이트에 검출하는 데 사용된 부피로 나눕니다(예: 2mL의 총 부피를 0.1mL의 희석되지 않은 균질산염으로 나눈 값은 검출 가능한 20CFU의 하한과 같습니다).

결과

그림 1: 마취기 설정. 사진은 유도 챔버와 청소부 시스템(생물 안전 캐비닛 내부)이 부착된 마취 기화기입니다.

그림 2: 전달된 비강 내 접종물의 계산. (A) ^{10-4, 10-5 및 10-6}으로 희석된 감염 접종물의 연속 희석의 개략도. 이러한 희석액을 10% BG + Sm에 도금하고 37°C에서 4일 동안 배양한 후 계수합니다. (B) 그런 다음 ^10-4, ^10-5 및 ^10-6...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
2L 인덕션 챔버	수의사 장비	941444
플루리소	수의사 1	V1 501017	모든 브랜드가 적합합니다.
카제인	시그마	C-7078
Bordet Gengou 한천 베이스	BD 생명과학	248200
악기 - 가위, 곡선 가위, 집게, 가는 집게, 삼각형 스프레더			모든 브랜드가 적합합니다.
15mL dounce 티슈 그라인더	휘튼	357544	유사한 브랜드가 적절합니다.
무선 핸드 균질화기	콘테스/시그마	Z359971-1개	유사한 브랜드가 적절합니다.
3mL 주사기	BD 생명과학	309657
15mL 원뿔형 튜브	어부	339651
1.5mL 마이크로디모지 튜브	덴빌	C2170
1mL 인슐린 주사기 28G1/2	피셔 사이언티픽/엑셀 Int.	Tel.: 14-841-31