Organelle Dynamics in B Lymphocytes following Activation with Antigen-Coated Beads

초록

출처: Ibañez-Vega, J., et al., 면역 시냅스 형성 중 B 세포의 세포 소기관 역학 연구. J. Vis. 특급. (2019년)

이 비디오에서는 항원 코팅된 마이크로비드로 활성화된 B 림프구의 소기관 역학을 연구하는 방법을 설명합니다.

프로토콜

>참고: 다음 단계는 IIA1.6 B 셀을 사용하여 수행되었습니다.

1. 항원 코팅 비드를 사용한 B 세포 활성화

1. 항원 코팅 비드의 준비
   1. B 세포를 활성화하기 위해 활성화(BCR-ligand+) 또는 비활성화(BCR-ligand-) 항원이 있는 3μm NH 2-beads의 50 μL(~20 x 10⁶ beads)를 사용하여 준비된 항원(Ag-coated beads)으로 공유 코팅된 NH_2-beads를 사용합니다.
   2. IIA1.6 B 세포의 경우 항-IgG-F(ab')₂ 단편을 BCR-리간드+로, 항-IgM-F(ab')₂ 또는 소 혈청 알부민(BSA)을 BCR-리간드-로 사용합니다. 일차 B 세포 또는 IgM+ B 세포주를 활성화하려면 항-IgM-F(ab')₂를 BCR-리간드+로, BSA를 BCR-리간드-.
      로 사용합니다. 메모: 리간드가 Fc 수용체에 결합하는 것을 피하려면 전장 항체 대신 F(ab') 또는 F(ab')₂ 항체 단편을 사용하십시오.
   3. Ag 코팅 비드의 준비를 진행하려면 비드를 저단백질 결합 마이크로 원심분리 튜브에 넣어 샘플 조작 중 비드의 회수율을 최대화합니다. 1x 인산염 완충 식염수(PBS) 1mL를 세척하여 비드를 세척하고 16,000 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 흡인합니다.
   4. 500μL의 8% 글루타르알데히드로 비드를 재현탁시켜 NH₂ 그룹을 활성화하고 실온(RT)에서 4시간 동안 회전합니다.
      주의: 글루타르알데히드 원액은 화학 흄 후드에만 사용해야 합니다. 물질안전보건자료(MSDS)의 지침을 따릅니다.
   5. 16,000 x g에서 5분 동안 원심분리기 비드를 가열하고 글루타르알데히드를 제거한 다음 1x PBS 1mL로 비드를 3회 더 세척합니다.
      주의: 글루타르알데히드 용액은 유해 화학 폐기물로 폐기해야 합니다.
   6. 활성화된 비드를 100μL의 1x PBS에 재현탁합니다. 샘플은 두 개의 저단백질 결합 미세원심분리 튜브로 나눌 수 있습니다: BCR-리간드+의 경우 50 μL, BCR-리간드의 경우 50 μL.
   7. 항원 용액을 준비하려면 150μL의 PBS에 100μg/mL의 항원 용액이 들어 있는 2mL 저단백질 결합 마이크로 원심분리 튜브 2개(BCR-리간드+가 있는 튜브 하나와 BCR-리간드가 있는 튜브 하나)를 사용합니다.
   8. 150μL의 항원 용액, 와류를 포함하는 각 튜브에 50μL의 활성 비드 용액을 추가하고 4°C에서 밤새 회전합니다.
   9. 500 μL의 10 mg/mL BSA를 첨가하여 비드에 남아 있는 반응성 NH₂ 그룹을 차단하고 4 °C에서 1시간 동안 회전합니다.
   10. 비드를 16,000 x g에서 4°C에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 제거합니다. 차가운 1x PBS로 구슬을 세 번 더 씻습니다.
   11. 활성화된 비드를 70μL의 1x PBS에 재현탁합니다.
   12. Ag 코팅된 비드의 최종 농도를 측정하려면 PBS(1:200)에서 소량의 비드를 희석하고 혈구계를 사용하여 계수합니다. 그런 다음 사용할 때까지 4 °C에서 보관하십시오 .
       메모: 은 코팅된 비드는 1개월 이상 보관해서는 안 됩니다.

2. 폴리-L-라이신 커버슬립의 제조

1. Ag 코팅 비드를 사용한 B 세포 활성화 분석 전에 폴리-L-라이신 코팅 커버슬립(PLL-커버슬립)을 준비합니다. 50% w/v 40mL의 PLL 용액이 들어 있는 0.01mL 튜브를 사용하고 12mm 직경의 커버슬립을 용액에 담그십시오. RT에서 밤새 회전합니다.
2. 1x PBS로 커버슬립을 세척하고 파라핀 필름으로 덮인 24웰 플레이트 뚜껑에서 건조시킵니다. B cell 활성화를 진행합니다.

3. B 세포 활성화

1. 비드로 B 세포 활성화를 시작하려면 먼저 IIA1.6 B 세포주를 CLICK 배지(2mM L-알라닌-L-글루타민 + 55μM 베타-메르캅토에탄올 보충 RPMI-1640 + 100 U/mL 페니실린 + 100μg/mL 스트렙토마이신) + 5% 열 비활성화 소 태아 혈청[FBS])에서 1.5 x 10⁶ cells/mL로 희석합니다.
2. 100 μL(150,000개 세포)의 IIA1.6 B 세포를 0.6 mL 튜브에서 1:1 비율로 Ag 코팅 비드와 결합합니다. 소용돌이를 사용하여 부드럽게 혼합하고 PLL 커버 슬립에 씨를 뿌립니다. 세포 배양 인큐베이터에서 다른 시점 동안 배양합니다 (37 ° C / 5 % CO₂). 일반적인 활성화 시점은 0분, 30분, 60분, 120분입니다. 시간 0의 경우 PLL 커버슬립을 얼음 위의 24웰 플레이트 뚜껑에 넣습니다. cells-Ag 코팅된 비드 혼합물을 추가하고 ice.
   에서 5분 동안 배양합니다. 메모: 피펫팅을 위아래로 하는 대신 와류로 혼합하는 것이 중요한데, 이는 피펫의 플라스틱 팁에 축적되어 샘플의 비드 수를 줄일 수 있기 때문입니다. BCR-리간드로 코팅된 비드를 각 분석에 대한 음성 대조군으로 사용합니다. 가장 긴 배양 시간을 먼저 활성화한 다음 다음 시점을 활성화하는 것이 좋습니다. 샘플이 동시에 고정될 준비가 되도록 샘플의 활성화 간격을 계산합니다.
3. 각 커버슬립에 100μL의 차가운 1x PBS를 추가하여 활성화를 중지하고 면역형광 프로토콜을 계속합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
IIA1.6(A20 변형) 마우스 B-림프종 세포	증권 시세	TIB-208	FcγIIR 없이 표면에 IgG 함유 BCR을 발현하는 Balb/c 기원의 쥐 B세포 림프종
100% 메탄올	피셔 사이언티픽	대답412-4
지름 10 mm, 커버 유리, 두께, No. 1, 원형	마리엔필드-수페리어	111500
아미노-다이나비드	써모피셔	14307디
안티 페리센트린	아브캠	ab4448	1:200 희석이 권장되지만 최적화해야 합니다
안티 rab6	아브캠	AB95954	1:200 희석이 권장되지만 최적화해야 합니다
안티 sec61	아브캠	AB15575	1:200 희석이 권장되지만 최적화해야 합니다
증권 시세	윙클러	BM-0150
폴리비드 아미노 마이크로스피어 3.00μm	폴리사이언스	17145-5
폴리-L-라이신	시그마	P8920	멸균수로 희석한다
RPMI-1640	생물 산업	01-104-1ᄀ
트리톤 X-100	머 크	9036-19-5
튜브 50ml	코 닝	353043

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