항원으로 코팅된 커버슬립(Coverslip)을 이용한 B 세포 활성화

초록

출처: Ibañez-Vega, J., et al., 면역 시냅스 형성 중 B 세포의 세포 소기관 역학 연구. J. Vis. 특급. (2019년)

이 비디오는 체외에서 B 세포 활성화를 보여줍니다. 이 과정에는 B 세포 수용체와의 항원 상호 작용이 포함되며, 이는 세포골격 리모델링, 면역 시냅스 형성, 리소좀 이동, 항원 내재화, 처리 및 B 세포 활성화를 위한 MHC 분자에 대한 후속 제시로 이어집니다.

프로토콜

1. 폴리-L-라이신 커버슬립의 제조

1. Ag 코팅 비드를 사용한 B 세포 활성화 분석 전에 폴리-L-라이신 코팅 커버슬립(PLL-커버슬립)을 준비합니다. 50% w/v 40mL의 PLL 용액이 들어 있는 0.01mL 튜브를 사용하고 12mm 직경의 커버슬립을 용액에 담그십시오. RT에서 밤새 회전합니다.
2. 커버 슬립을 1xPBS로 세척하고 파라핀 필름으로 덮인 24웰 플레이트 뚜껑에서 건조시킵니다. B cell 활성화를 진행합니다.

2. 항원 코팅된 커버슬립에서 B 세포 활성화

1. 항원 코팅된 커버슬립의 준비
   1. 활성화하기 전에 항원 용액(10μg/mL BCR-리간드+ 및 0.5μg/mL 쥐 항마우스 CD45R/B220을 포함하는 1x PBS)을 준비합니다.
   2. 참고: 분석 전날 커버슬립을 준비하는 것이 좋습니다. B220은 B 세포 부착을 개선하지만 BCR-리간드+는 확산 반응을 생성하기에 충분합니다.
   3. 파라핀 필름으로 덮인 24웰 플레이트 뚜껑에 12mm 커버슬립을 놓고 각 커버슬립에 40μL의 항원 용액을 첨가한 다음 4°C에서 밤새 배양합니다. 항원 용액의 증발을 방지하기 위해 플레이트를 밀봉하십시오.
   4. 1x PBS로 커버슬립을 세척하고 자연 건조합니다.
2. B 세포 활성화
   1. 활성화를 시작하려면 IIA1.6 B 세포를 CLICK 배지 + 5% FBS에서 1.5 x 10⁶ cells/mL로 희석합니다.
   2. 항원 코팅된 커버슬립(Ag-coverslip)에 100μL의 세포를 추가하고 37°C/5% CO₂의 세포 배양기에서 다른 시점으로 활성화합니다. 일반적인 활성화 시점은 0, 30 및 60분입니다.
      메모: 섹션 1에서와 같이 모든 샘플을 동시에 고정하기 위해 가장 긴 활성화 시점부터 시작하는 것이 좋습니다.
   3. 시간 0의 경우 Ag-coverslip이 들어 있는 24웰 플레이트 뚜껑을 얼음 위에 놓고 세포를 추가합니다. 얼음 위에서 5분 동안 배양합니다.
   4. 각 Ag-커버슬립에서 배지를 조심스럽게 흡입한 다음 100μL의 차가운 1x PBS를 추가하여 활성화를 중지합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
IIA1.6(A20 변형) 마우스 B-림프종 세포	증권 시세	TIB-208	FcγIIR 없이 표면에 IgG 함유 BCR을 발현하는 Balb/c 기원의 쥐 B세포 림프종
염화나트륨2	윙클러	CA-0520
글리신	윙클러	BM-0820
HyClone 소 태아 세럼	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	SH30071.03	56°C에서 30분 동안 가열 비활성화
케이클	윙클러	폴-1260
염화나트륨	윙클러	이로-1455
파라필름	미디엄	P1150-2
페니실린-스트렙토마이신	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	15140122	액체
폴리-L-라이신	시그마	P8920	멸균수로 희석한다
RPMI-1640	생물 산업	01-104-1ᄀ
나트륨 피루브산	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	11360070
튜브 50ml	코 닝	353043
2-메르캅토에탄올	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	21985023
글루타민	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	35050061
염소-안티-마우스 IgG 항체	잭슨 이뮤노리서치	Tel.: 315-005-003	IIA1.6 양성 리간드

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