생쥐 골수 세포의 골수 형성에 대한 Anti C-fms 항체의 효과시험관 내

초록

출처: Marahleh, A., et al. 체외 골세포의 형성 및 증식에 대한 Anti-c-fms 항체의 효과. J. Vis. 특급 (2019년)

이 비디오에서는 파골세포 전구세포의 파골세포 형성 과정인 파골세포 형성에 대한 다양한 항-c-fms 항체 농도의 효과를 보여줍니다.

프로토콜

1. BMM의 생성

1. 10cm 배양 접시에 1 x 10⁷ cells/10 mL를 파종하고 M-CSF 100 ng/mL를 추가합니다. M-CSF의 최종 농도는 배양 배지 100ng/mL입니다. 37 °C, 5 % CO₂에서 3 일 동안 배양합니다.
2. 3일 후, 배양액을 제거하고 10mL의 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 2회 격렬하게 세척하여 비부착 세포를 제거하고 PBS에 실온 0.02% 트립신-EDTA 5mL를 첨가하고 37°C, 5% CO₂에서 5분 동안 배양합니다.
3. 철저한 피펫팅으로 세포를 분리합니다. 현미경으로 배양물을 관찰하여 세포가 분리되었는지 확인합니다(세포는 둥글고 배지에 떠 있는 것처럼 보여야 함). 세포가 부착된 상태로 남아 있으면 피펫팅을 철저히 반복하여 세포를 분리합니다. 세포가 분리되면 5mL의 α-MEM을 추가하여 반응을 비활성화합니다.
4. 세포를 50mL 원뿔형 튜브에 넣고 300 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버리고 5mL의 α-MEM으로 세척합니다.
5. 300 x g에서 5분 동안 원심분리기를 하고 펠릿을 10mL의 α-MEM에 재현탁합니다.
6. 셀 계수를 수행합니다.
7. 10cm 배양 접시에 1 x 10⁶ cells/10 mL를 파종하고 M-CSF 100 ng/mL를 추가합니다. M-CSF의 최종 농도는 배양 배지 100ng/mL입니다. 37 °C, 5 % CO₂에서 3 일 동안 배양합니다.

2. BMM에서 골세포를 골세포세포의 전구체로 생성

1. 3일 후, 1.2-1.7 단계에 따라 BMM을 파골세포 전구체로 나타내는 부착 세포를 수확합니다.
2. 96웰 플레이트의 5 x 10⁴셀/200μL의 α-MEM에서 BMM을 시딩합니다. 최종 농도 50ng/mL에 대해 RANKL을 추가하거나 최종 농도 100ng/mL에 대해 TNF-α를 추가합니다. 각 웰에 100ng/mL의 최종 농도를 위해 M-CSF를 추가합니다.
3. 각 웰에 anti-c-fms 항체(최종 농도 0, 1, 10, 100, 1000ng/mL)를 추가합니다.
4. 37 ° C, 5 % CO₂에서 4 일 동안 배양합니다. 4일 동안 격일로 미디어를 교체합니다.

3. 주석산염 내성 산성 인산가수분해효소(TRAP) 염색

1. 4일간의 배양 후 각 웰의 배양 배지를 부드럽게 흡인합니다. 200μL의 실온 1x PBS로 각 웰을 한 번 세척합니다.
2. 고정을 위해 각 웰에 200μL의 10% 포르말린을 추가하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 포르말린을 흡인하고 탈이온수로 각 웰을 3회 세척합니다.
3. 투과화를 위해 PBS의 0.2% Triton X-100 200μL를 각 웰에 추가하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. Triton X-100을 흡인하고 각 웰을 탈이온수로 3회 세척합니다.
4. 각 웰에 200μL의 TRAP 염색 용액을 추가합니다. 현미경으로 얼룩을 시각화합니다. 얼룩이 제대로 생기는 데 10-30분이 걸립니다.
5. 얼룩을 흡인하고 탈이온수로 각 웰을 3회 세척하고 자연 건조합니다. 추가 관찰에 사용할 수 있도록 실온에 보관하십시오.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
anti-c-Fms 항체			AFS98, 랫드 단클론, 항뮤린, c-Fms 항체(IgG2a)
랭클	페프로텍	315-11	재조합 쥐 sRANK 리간드, 출처: E.coli
M-CSF			재조합 인간 M-CSF. 10cm 현탁액 배양 접시에서 5X106 세포에서 CMG14–12 세포주 배양 상등액의 1/10 vol.
α-MEM	와코		L-글루타민과 페놀 레드 함유
소 태아 세럼	바이오웨스트	S1820-500	소 태아 세럼 프렌치 오리진
문화 요리	코 닝		100mm x 20mm 스타일 접시
96웰 플레이트	써모피셔 사이언티픽		Nun clon 델타 표면

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