성충 파리의 숙주-바이러스 상호작용을 연구하기 위한 흉곽내 바이러스 나노 주사

초록

출처: Yang, S., et al. Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila melanogaster(초파리 melanogaster에서 바이러스 감염 및 숙주-바이러스 상호 작용 분석). J. Vis. 특급 (2019).

이 비디오에서는 양성 감각의 단일 가닥 RNA 바이러스를 성인 수컷 초파리에 나노 주입하는 절차를 설명하고 이후 감염으로 인해 시작된 항바이러스 반응을 연구합니다. 중합효소 연쇄 반응 분석은 RNA 간섭 및 JAK/STAT 신호 전달을 포함한 면역 반응 경로의 활성화를 나타내는 감염된 파리의 특정 유전자의 상향 조절을 식별합니다.

프로토콜

1. 초파리의 바이러스 감염

1. 나노 주입으로 파리를 감염시키고 생존 분석을 수행합니다.
   1. 모세 혈관을 당겨 주사 바늘을 준비하고 주사 바늘에 오일을 다시 채우고 인젝터를 조립합니다.
   2. 마취는 CO₂ 의 가벼운 흐름에서 패드에서 비행합니다. 50.6 nL의 바이러스 용액(100 PFU, Tris-HCl 완충액으로 희석, pH 7.2)을 흉부 내 주사하여 파리를 접종합니다. 최소 3개의 파리를 주입합니다(바이알당 파리 20마리).
      메모: 주사하는 데 시간이 많이 걸리고(일반적으로 시간당 100마리) 초파리 C 바이러스(DCV) 복제가 매우 빠르기 때문에 각 바이알(20파리)을 완성한 후 튜브에 정확한 시간을 기록하는 것이 매우 중요합니다. 버퍼 전용 주입은 모의 컨트롤로 설정됩니다. 일반적으로 수컷 성충 파리가 선호되는데, 짝짓기 및 번식 중 호르몬 변화가 암컷의 판독에 영향을 미칠 수 있기 때문에 암컷을 사용할 때보다 결과가 더 안정적이고 재현 가능하기 때문입니다.
   3. 주입된 파리를 정상적인 명암 주기에서 25°C, 60% 습도에서 성장시킵니다. 파리에게 매일 신선한 음식을 공급하고 죽은 파리의 수를 기록합니다.
   4. 최소 3번의 생물학적 복제를 수행하고 생존 곡선을 플롯합니다.
   5. 생존 데이터의 통계적 분석을 위해 통계 소프트웨어를 사용하여 Kaplan-Meier 생존 곡선을 생성합니다. 로그 순위 검정을 수행하여 P 값을 계산합니다. 생존 테이블에서 각 주제에 대한 정보를 입력합니다. 그런 다음 각 시간에서의 생존율을 계산하고 Kaplan-Meier 생존율 플롯을 플로팅합니다.
      메모: 바이알에 효모를 추가하지 마십시오. 모의 대조군과 비교했을 때, DCV에 감염된 파리는 때때로 복수가 있고 서투르기 때문에 끈적끈적한 효모에 취약합니다. 감염된 파리의 대량 폐사가 발생하는 시간대를 알아내기 위해 예비 실험에서 더 많은 시점을 기록하는 것이 좋습니다. 일반적으로 감염된 파리는 Dicer-2 돌연변이 계통의 경우에도 처음 이틀 이내에 죽는 경우가 거의 없습니다. 100 PFU의 DCV에 감염된 Wolbachia-free w1118 (Bloomington 5905) 파리의 경우 이 기간은 감염 후 약 3-5일입니다. 주사 후 0.5시간 이내에 죽은 초파리는 바이러스 감염이 아닌 주사 바늘 부상으로 죽을 수 있으므로 사망으로 간주되어서는 안 됩니다.

2. 세포요법 효과(CPE) 분석에 의한 DCV 부하 측정

1. 1일차에 1.1.1-1.1.2 단계에 설명된 대로 수컷 파리를 감염시킵니다. 주입된 파리를 20마리의 그룹으로 그룹화하고 원하는 시간(일반적으로 24시간 또는 3일 동안) 동안 신선한 파리 먹이를 먹고 계속 자랍니다. 파리에게 매일 신선한 음식을 제공하십시오.
2. 2일차에 10cm 세포 배양 접시에 초파리 S2* 세포를 약 5 x10⁶ - 1x10⁷ cells/mL의 밀도로 파종합니다.
3. 3일차에 파리 5마리(CO₂의 가벼운 흐름 아래)를 채취하고 균질기를 사용하여 200μL의 Tris 완충액과 세라믹 비드를 사용하여 1.5mL 원심분리 튜브에서 30초 동안 분쇄합니다. 샘플을 -80°C에서 보관하거나 즉시 다음 단계로 진행하십시오.
4. 샘플을 철저히 와류로 만듭니다. 1mL 주사기와 0.22μm 필터를 사용하여 상층액을 새 1.5mL 튜브로 여과합니다.
5. S2* 세포에 대한 완전한 배지로 상층액의 연속 10배 희석을 수행합니다. 웰에 50μL 희석액을 추가합니다. 바이러스가 없는 배양 배지 50μL를 음성 대조군 well.
   로 분류된 웰에 추가합니다. 메모: 각 희석 속도에 대해 8개의 웰이 사용되었습니다. 일반적인 DCV 수율은 약 10^{8-10 9} PFU/mL이므로 희석액은 최소한 ~10-5-10-10^을 커버해야 합니다.
6. 4일차에는 20X 또는 40X 대물렌즈가 있는 명시야 현미경으로 CPE를 관찰합니다. 세포가 흐릿하게 보이고 매질에 단편이 가득 찬 웰을 "positive well"로, 세포 형태가 정상인 well을 "negative well"로 분류합니다.
7. CPE 양극 또는 음수 웰을 각각 + 또는 –로 표시합니다. 평균 바이러스 조직 배양 감염 선량(TCID₅₀)을 계산합니다.

3. qRT-PCR로 측정한 DCV 부하

1. 1일차에는 위에서 설명한 대로 파리를 감염시킵니다. 집단 주입된 수컷 파리(20마리/그룹)를 원하는 시간(일반적으로 24시간 또는 3일 동안) 동안 신선한 파리 먹이로 키웁니다. 파리에게 매일 신선한 음식을 제공하십시오.
2. 3일차에 200μL의 용해 완충액과 20개의 세라믹 비드(직경 = 0.5mm)가 있는 1.5mL 튜브에 CO₂의 가벼운 흐름 아래에서 5마리의 파리를 수집하고 균질기로 30초 동안 고속으로 샘플을 분쇄합니다. 각 튜브에 800μL의 추가 용해 완충액을 추가하고 샘플을 -80°C에서 보관하거나 즉시 RNA 추출 및 qRT-PCR을 수행합니다.
3. RNase가 없는 팁, 튜브 및 탈이온화된 디에틸피로카보네이트(DEPC) 처리 및 0.22μm 멤브레인 여과수를 준비합니다. 샘플에 클로로포름 200μL(≥99.5%)를 넣고 손으로 15초 동안 세게 흔듭니다. 물 단계와 유기 단계가 명확하게 분리될 때까지 실온에서 5분 이상 배양합니다.
   메모: 클로로포름은 매우 위험하므로 주의해서 다루어야 합니다. DNA 오염의 위험을 증가시키는 샘플을 소용돌이치지 마십시오.
4. 13,000 x g에서 4°C에서 15분 동안 원심분리기 시료.
5. 400μL의 상층액을 모아 상층액을 새 튜브로 옮깁니다. 동일한 부피의 이소프로판올(≥ 99.5%)과 혼합하고 샘플을 손으로 20회 부드럽게 뒤집은 다음 실온에서 10분 이상 침전시킵니다.
   메모: -20°C에서 강수량은 RNA 수율을 증가시킵니다.
6. 4°C에서 10분 동안 13,000 x g의 원심분리기 샘플. 튜브 바닥에서 흰색 RNA 펠릿이 보입니다.
7. 상등액을 버리고 1mL의 70% 에탄올(DEPC 물에 에탄올)을 넣고 몇 번 반전시켜 RNA를 세척합니다.
8. 4°C에서 5분 동안 13,000 x g에서 원심분리 샘플. 상층액 및 건조 RNA를 5-10분 동안 폐기합니다. RNA는 투명해져야 합니다.
9. 샘플에 DEPC 물 50μL를 추가하고 몇 번 피펫팅한 후 와류를 수행합니다.
10. RNA 농도를 적정하기 위해 3μL의 RNA를 취합니다. 260nm에서 RNA를 정량화합니다. 일반적으로 이 프로토콜에 의해 추출된 RNA 농도는 약 100-500μg/μL로 cDNA 합성에 적합합니다.
11. cDNA 합성을 위해 2μg의 RNA를 사용합니다. ddH₂O로 샘플을 100 μL로 희석하고 -20 °C에서 보관합니다.
12. 제조업체의 지침에 따라 qRT-PCR을 수행하고 qRT-PCR.
    를 실행합니다. 메모: DCV의 cDNA 합성의 경우, 무작위 프라이머가 Poly A 프라이머보다 훨씬 효과적이었습니다. DCV mRNA 발현은 내인성 리보솜 단백질 49 (rp49) mRNA로 정규화됩니다. 이 부분에서 이용되는 올리고뉴클레오티드 뇌관:
    rp49 5' AGATCGTGAAGAAGCGCACCAAG 3' (전방) 및
    5' CACCAGGAACTTCTTGAATCCGG 3' (역);
    DCV, 5' TCATCGGTATGCACATTGCT 3' (전방) 및
    5' CGCATAACCATGCTCTTCTG 3' (역);
    vago, 5' TGCAACTCTGGGAGGATAGC 3' (앞으로) 및
    5' AATTGCCCTGCGTCAGTTT 3'(역);
    바이러스 유도 RNA 1 (vir-1) 5' GATCCCAATTTTCCCATCAA 3' (앞으로) 및
    5' GATTACAGCTGGGTGCACA 3' (역).

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
현미경	올림푸스	CKX41
Nanoject II 자동 나노리터 주입기	드러먼드 사이언티픽	3-000-204	Nanoject II 가변 부피 (2.3 - 69 nL) 유리 모세 혈관이 있는 자동 주입기 (110V)
슈나이더의 곤충 매체	시그마	S9895	세포 배양
10cm 세포 배양 접시	시그마	CLS430167	세포 배양
초파리 인큐베이터	퍼시벌	41NL	초파리 사육
0.22um 여과기	밀리포어	SLGP033RS
1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브	낙인	352070
1.5 ml RNase-free 마이크로 원심분리기 튜브	액시겐	MCT-150-C
ABI 7500 qPCR 시스템	아비	7500	qPCR
원심 분리기	에펜도르프	5810R
원심 분리기	에펜도르프	5424R
클로로포름	시그마	151858	RNA 추출
DEPC 물	시그마	95284-100ML	RNA 추출
이소프로필 알코올	시그마	I9516 (영어	RNA 추출
용해 완충액(RNA 추출)	써모 피셔	15596026	TRIzol 시약
용해 완충액(액체 시료 RNA 추출)	써모 피셔	10296028	TRIzol LS 시약
광학 접착 필름	아비	4360954	qPCR
페니실린-스트렙토마이신, 액상	인비트로젠	15140-122	세포 배양
qPCR 플레이트	아비	A32811	qPCR
통계 소프트웨어	GraphPad 프리즘 7
TransScript Fly First-Strand cDNA 합성 SuperMix	트랜스스크립트	AT301	RNA 추출
소용돌이	이카	소용돌이 3	RNA 추출
FBS(증권 시세	인비트로젠	제12657-029	세포 배양
평평한 바닥 96웰 플레이트	시그마	CLS3922	세포 배양
세포 배양기	산요	미르-553
교체용 튜브 100	드러먼드 사이언티픽	3-000-203-G/X

년 ) 년 표시기 호 개