성충 파리의 숙주-바이러스 상호작용을 연구하기 위한 흉곽내 바이러스 나노 주사

초록

출처: Yang, S., et al. Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila melanogaster(초파리 melanogaster에서 바이러스 감염 및 숙주-바이러스 상호 작용 분석). J. Vis. 특급 (2019).

이 비디오에서는 양성 감각의 단일 가닥 RNA 바이러스를 성인 수컷 초파리에 나노 주입하는 절차를 설명하고 이후 감염으로 인해 시작된 항바이러스 반응을 연구합니다. 중합효소 연쇄 반응 분석은 RNA 간섭 및 JAK/STAT 신호 전달을 포함한 면역 반응 경로의 활성화를 나타내는 감염된 파리의 특정 유전자의 상향 조절을 식별합니다.

프로토콜

1. 초파리의 바이러스 감염

1. 나노 주입으로 파리를 감염시키고 생존 분석을 수행합니다.
   1. 모세 혈관을 당겨 주사 바늘을 준비하고 주사 바늘에 오일을 다시 채우고 인젝터를 조립합니다.
   2. 마취는 CO₂ 의 가벼운 흐름에서 패드에서 비행합니다. 50.6 nL의 바이러스 용액(100 PFU, Tris-HCl 완충액으로 희석, pH 7.2)을 흉부 내 주사하여 파리를 접종합니다. 최소 3개의 파리를 주입합니다(바이알당 파리 20마리).
      메모: 주사하는 데 시간이 많이 걸리고(일반적으로 시간당 100마리) 초파리 C 바이러스(DCV) 복제가 매우 빠르기 때문에 각 바이알(20파리)을 완성한 후 튜브에 정확한 시간을 기록하는 것이 매우 중요합니다. 버퍼 전용 주입은 모의 컨트롤로 설정됩니다. 일반적으로 수컷 성충 파리가 선호되는데, 짝짓기 및 번식 중 호르몬 변화가 암컷의 판독에 영향을 미칠 수 있기 때문에 암컷을 사용할 때보다 결과가 더 안정적이고 재현 가능하기 때문입니다.
   3. 주입된 파리를 정상적인 명암 주기에서 25°C, 60% 습도에서 성장시킵니다. 파리에게 매일 신선한....

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
현미경	올림푸스	CKX41
Nanoject II 자동 나노리터 주입기	드러먼드 사이언티픽	3-000-204	Nanoject II 가변 부피 (2.3 - 69 nL) 유리 모세 혈관이 있는 자동 주입기 (110V)
슈나이더의 곤충 매체	시그마	S9895	세포 배양
10cm 세포 배양 접시	시그마	CLS430167	세포 배양
초파리 인큐베이터	퍼시벌	41NL	초파리 사육
0.22um 여과기	밀리포어	SLGP033RS
1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브	낙인	352070
1.5 ml RNase-free 마이크로 원심분리기 튜브	액시겐	MCT-150-C
ABI 7500 qPCR 시스템	아비	7500	qPCR
원심 분리기	에펜도르프	5810R
원심 분리기	에펜도르프	5424R
클로로포름	시그마	151858	RNA 추출
DEPC 물	시그마	95284-100ML	RNA 추출
이소프로필 알코올	시그마	I9516 (영어	RNA 추출
용해 완충액(RNA 추출)	써모 피셔	15596026	TRIzol 시약
용해 완충액(액체 시료 RNA 추출)	써모 피셔	10296028	TRIzol LS 시약
광학 접착 필름	아비	4360954	qPCR
페니실린-스트렙토마이신, 액상	인비트로젠	15140-122	세포 배양
qPCR 플레이트	아비	A32811	qPCR
통계 소프트웨어	GraphPad 프리즘 7
TransScript Fly First-Strand cDNA 합성 SuperMix	트랜스스크립트	AT301	RNA 추출
소용돌이	이카	소용돌이 3	RNA 추출
FBS(증권 시세	인비트로젠	제12657-029	세포 배양
평평한 바닥 96웰 플레이트	시그마	CLS3922	세포 배양
세포 배양기	산요	미르-553
교체용 튜브 100	드러먼드 사이언티픽	3-000-203-G/X

년 ) 년 표시기 호 개