DSS 유발 대장염에서 결장 손상을 평가하기 위한 Hematoxylin 및 Eosin 염색

초록

출처: Du, Y., et al. 염증성 장 질환 마우스 모델에서 장 염증에 대한 미각 신호 단백질 폐지의 효과. J. Vis. 특급 (2018)

이 비디오는 염증성 장 질환인 DSS 유발 대장염의 쥐 모델에서 결장 손상을 평가하기 위한 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색 방법을 보여줍니다. DSS를 투여한 쥐에서 결장을 분리하고 조직 절편을 채취한 후, 해당 절편의 H&E 염색은 염증에 의한 조직 손상을 확인하는 데 도움이 됩니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 마우스와 DSS의 준비

1. 녹아웃(α-gustducin^-/-) 마우스와 연령, 성별 및 체중이 일치하는 야생형 대조군(α-gustducin^+/+) C57BL/6 마우스를 깨끗한 케이지에 개별적으로 보관하십시오.
   메모: 녹아웃 마우스는 20세대 이상 동안 C57BL/6 마우스와 역교배되었으며 거의 100% C57BL/6 유전적 배경을 가지고 있습니다.
2. 30g의 덱스트란 설페이트 나트륨(DSS) 분말을 1L의 고압증기멸균수에 녹입니다. 용액이 투명해질 때까지 혼합하여 최종 작업 농도가 3%(w/v).
   이 되도록 합니다. 메모: DSS 솔루션은 최대 1주일 동안 실온에서 보관하거나 사용할 때까지 4°C에서 보관할 수 있습니다.

2. 생쥐의 DSS 대장염 유도 및 평가

1. 각 마우스의 초기 체중을 측정하고 기록합니다. 마우스를 표준 플라스틱 케이지에 개별적으로 넣고 케이지에 라벨을 붙입니다.
2. 일반 식수를 총 7일 동안 3% DSS 용액으로 교체하여 두 그룹의 마우스 모두 자유자재로 사용할 수 있습니다.
3. 마우스의 체중을 측정하고, DSS 용액 소비량을 기록하고, DSS 투여 기간 동안 매일 각 마우스의 대변을 수집 및 검사합니다. 설사 및 직장 출혈의 중증도를 관찰하고 이를 DSS 유발 질환 지수로 변환합니다.
4. 실험 중에 초기 체중 대비 체중 감소율과 질병 지수를 계산하여 대장염의 증상을 평가합니다.
   메모: 질병 지수는 설사와 직장 출혈에 대한 관찰을 결합하여 점수가 매겨지며 0(정상 대변, 혈액 없음), 1(부드러운 대변, 혈액 없음), 2(부드러운 대변, 혈액 적음), 3(매우 부드러운 대변, 경미한 출혈) 및 4(물변, 상당한 출혈)로 정의됩니다. 질병 지수는 각 마우스에 대해 매일 분석됩니다.
5. 7일간의 DSS 치료가 끝날 때까지 경추 탈구로 마우스를 희생하고 나머지 실험을 진행합니다.

3. 조직 샘플의 준비

1. 마우스를 누운 자세로 놓고 70 % 에탄올로 복부 피부를 청소합니다. 작은 가위로 복부를 3cm 길이의 정중선 절개하여 복강을 노출시킵니다.
2. 집게를 사용하여 비장을 다른 조직과 조심스럽게 분리한 다음 비장을 제거하고 크기를 측정합니다.
3. 집게로 결장을 확인하고 들어 올려 주변 장간막과 분리합니다. 맹장과 직장이 보일 때까지 결장 전체를 당겨 빼냅니다.
4. 대장 가장자리와 골반 깊숙한 곳에서 결장을 횡절하여 결장을 분리하여 각각 근위 및 원위 결장을 해제합니다. 그런 다음 분리된 결장의 길이를 측정하고 기록합니다. 절제 과정에서 결장 조직이 손상되지 않도록 주의하십시오.
간침이
5. 장착된 10mL 주사기로 얼음처럼 차가운 인산염 완충 식염수(PBS) 10mL로 결장을 세척하여 용출액이 완전히 투명해질 때까지 대변과 혈액을 제거합니다.
6. 조직학적 식별을 위해 조직 샘플을 근위부, 중간부, 원위부의 세 부분으로 균등하게 나눕니다. 그런 다음 4°C에서 밤새 4% 파라포름알데히드(PFA)로 조직을 고정합니다.

4. DSS로 인한 대장염의 중증도에 대한 조직학적 평가

1. 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색
   1. 고정 후 조직을 15mL 튜브에 1x PBS의 30% 자당 용액에 하룻밤 동안 담가 샘플을 동결 보호합니다.
   2. 조직을 최적 절단 온도(OCT) 화합물에 삽입하고 OCT가 굳을 때까지 -20°C에 놓습니다.
   3. 조직을 포함하는 OCT 블록을 저온 유지 장치로 옮기고, 저온 유지 장치의 두께 다이얼을 12μm로 설정하고, 12μm 두께의 동결 절편을 잘라 수집합니다.
   4. 저온 유지 장치에서 수집된 조직 절편을 65°C에서 핫 플레이트에서 20분 동안 가열합니다.
   5. 증류수로 섹션을 잠시 씻으십시오. 헤마톡실린 염색 용액으로 5분 동안 염색한 다음 흐르는 수돗물로 5분 동안 헹굽니다.
   6. 0.5% 염산-에탄올로 섹션을 30초 동안 구별하고 흐르는 수돗물에 1분 동안 헹굽니다. 그런 다음 1x PBS에서 1분 동안 세탁한 다음 흐르는 수돗물로 5분 동안 헹굽니다.
   7. 조직 절편을 70%, 75%, 80%, 95% 알코올로 각각 10초씩 세척합니다. 에오신 염색 용액에서 2분 동안 counterstain합니다.
   8. 95% 알코올을 통해 탈수를 수행하고 매번 5분 동안 2회 절대 알코올 변경을 수행합니다. 자일렌을 5분 동안 2번 바꾸어 클리어합니다.
   9. 위의 H&E 염색 결과를 기반으로 유전자 녹아웃(gene knockout) 및 야생형 그룹 모두에 대해 각 마우스의 근위, 중간 및 원위 결장의 근위, 중간 및 원위 결장의 조직 손상을 점수화합니다.
      메모: 질병 지수는 점막, 점막하, 근육 및 장막 영역의 상피 손상 및 염증을 결합한 점수로, 0(조직 손상 및 염증 없음), 1(국소 조직 손상 및 염증), 2(고르지 못한 조직 손상 및 염증) 및 3(미만성 조직 손상 및 염증)으로 정의됩니다. 그런 다음 결장의 근위부, 중간부, 원위부에 대한 마우스당 3개의 점수를 합산하여 각 동물에 대한 총점을 얻습니다. 그런 다음 각 그룹의 평균 점수가 계산됩니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
덱스트란 황산염 나트륨염(DSS)	MP 바이오메디컬	2160110
H&E 염색 키트	BBI 생명과학	E607318
인산염 완충 식염수(PBS)	(주)상곤바이오텍	B548117
BD 10ml 주사기	BD 바이오사이언스	309604
기기 및 장비
저울
가위
집게
염색 용기
소프트웨어
IMAG-PRO 플러스	미디어 사이버네틱스, Inc.