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인간 참가자와 관련된 모든 절차는 인간 복지를 위한 제도적, 국가적, 국제적 지침에 따라 수행되었으며 지역 기관 검토 위원회의 검토를 거쳤습니다.
1. 인간 단핵구의 분리 및 대식세포로의 분화
- 지역 혈액 은행에서 비식별화된 건강한 개인으로부터 항응고된 혈액을 얻고 아래와 같이 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 분리합니다.
메모: 조직 배양 층류 후드에서 모든 단계를 수행합니다. 멸균 튜브만 사용하고 장갑을 착용하십시오. 폐기 시 모든 혈액 관련 제품에 10% 표백제를 첨가하십시오. 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)(1x) 또는 Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS)(Ca2+ 및 Mg2+ 제외)를 상호 교환하여 사용할 수 있습니다.
- 희석 완충액 준비: 1x 멸균 PBS에 2% 소 태아 혈청(FBS) 및 0.5mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)을 보충합니다.
- 배양 배지 준비: RPMI-1640 배지에 FBS(10%(v/v)), 글루타맥스(2mM) 및 페니실린/스트렙토마이신(50 I.U./50 μg/mL)을 보충합니다.
- 제조업체의 프로토콜에 따라 실행 버퍼(Table of Materials)를 예냉각합니다.
- 두 부피의 희석 완충액으로 전혈을 희석합니다. 혈청학적 피펫을 사용하여 항응고된 혈액 15mL를 30mL의 희석 완충액이 들어 있는 50mL 튜브로 옮깁니다. 반전으로 부드럽게 섞습니다.
- 전혈 10mL 또는 희석된 혈액 30mL마다 50mL의 빈 튜브에 15mL의 밀도 구배 배지를 추가합니다.
- 25mL 혈청학적 피펫을 사용하여 1.1.5단계의 밀도 구배 배지에 30mL의 희석된 혈액을 천천히 꾸준히 적층합니다. 피펫의 끝을 튜브의 벽과 튜브의 기울어진 각도에 대십시오.
- 튜브를 스윙 버킷 원심분리기로 조심스럽게 옮깁니다. 두 단계를 방해하지 마십시오. 400 x g의 실온(RT)에서 가속 및 감속을 최소값으로 설정하고 25분 동안 튜브를 원심분리합니다.
- 10mL 피펫을 사용하여 상단(투명) 혈장층을 조심스럽게 제거하고 표백제(10%)가 든 용기에 폐기합니다.
- 10mL 피펫으로 말초 혈액 단핵 세포(PBMC, 그림 1)의 계면(흰색) 층을 수집하고 새로운 50mL 튜브로 옮깁니다. 동일한 기증자의 다른 튜브에서 흰색 층을 50mL 튜브에 최대 30mL까지 결합합니다.
- 1.1.1단계의 희석 완충액을 사용하여 각 튜브를 총 부피 50mL로 가져오고 300 x g 및 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다. 10mL 피펫으로 상등액을 제거하고 표백제(10%)가 든 용기에 폐기합니다.
- p1000 마이크로피펫을 사용하여 1.1.3단계의 사전 냉각된 러닝 버퍼 1mL에 각 세포 펠릿을 재현탁합니다. 동일한 공여자의 세포 현탁액을 새로운 15mL 튜브에 결합합니다. 사전 냉각된 러닝 버퍼를 사용하여 각 튜브의 부피를 15mL로 가져오고 반전으로 잘 혼합합니다.
- 1.1.11단계에서 세포 현탁액 20μL를 분취하고 1x 멸균 PBS를 사용하여 1:100 희석액을 준비합니다. 혈구계를 사용하여 세포 수를 확인합니다.
- 300 x g 및 4°C에서 10분 동안 1.1.11단계의 세포 현탁액을 원심분리하고 10mL 피펫으로 상층액을 제거합니다. 필요한 경우 p200 마이크로피펫을 사용하여 상층액을 완전히 제거합니다.
- 각 1 x 107 셀에 대해 80μL의 사전 냉각된 MACS 러닝 버퍼에 분리된 PBMC를 재현탁시켜 최대 800μL의 버퍼를 추가합니다.
- 각 1 x 107 세포당 20μL의 항인간 CD14 MicroBeads 또는 혈액 샘플당 최대 100μL(~100mL의 희석되지 않은 혈액)를 추가합니다. 반전으로 잘 혼합하고 4 °C에서 연속 혼합으로 20 분 동안 튜브 로테이터에 놓습니다.
- 튜브 로테이터에서 샘플을 제거하고 각 튜브에 예냉각된 러닝 버퍼 10mL를 추가한 다음 300 x g(가속 = 5, 감속 = 5) 및 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다.
- 10mL 피펫으로 상층액을 제거하고 500μL의 사전 냉각된 러닝 버퍼(2 x 108/mL)에 최대 1 x 108 세포를 재현탁합니다.
- 제조업체의 지침에 따라 수동 또는 자동 시스템(Table of Materials)을 사용하여 자기 세포 분류를 통해 CD14 양성 세포를 분리합니다.
- CD14 양성 선택 후 1.1.18단계에서 세포 현탁액 20μL를 취하고 1x 멸균 PBS를 사용하여 1:100 희석을 준비합니다. 혈구계에서 세포를 세어 세포 수를 결정합니다.
- CD14 양성 세포를 300 x g에서 원심분리하고 10분 동안 실온합니다. 10mL 피펫 또는 진공 시스템을 사용하여 상층액을 제거합니다.
- 1.1.20단계의 세포 펠릿을 1.1.2단계의 예열된 배양 배지에서 1 x 107 cells/mL의 최종 세포 밀도까지 재현탁합니다.
- 분리된 CD14 양성 단핵구를 5 x 106 세포의 세포 밀도로 파종합니다.
- 10cm 조직 배양 접시에 50ng/mL 과립구-대식세포 집락자극인자(GM-CSF)가 보충된 1.1.2단계의 배양 배지 10mL를 추가합니다.
- 1.1.21단계의 세포 현탁액 0.5mL를 배양 배지에 적가하고 플레이트를 부드럽게 소용돌이칩니다. 가습된 조직 배양 인큐베이터(37 °C, 5% CO2)에서 밤새 세포를 배양합니다.
- 다음 날, 진공 시스템을 사용하여 배지를 흡인하여 밤새 부착되지 않은 세포를 제거합니다. GM-CSF(50ng/mL)가 보충된 신선한 배양 배지 10mL를 추가하고 가습된 조직 배양 인큐베이터(37°C, 5% CO2)에서 세포를 7일 동안 배양하여 완전한 분화를 허용합니다(GM-CSF의 다양한 분화 단계에서 CD14+ 단핵구의 출현은 그림 2A 참조). 배양 배지를 2-3일마다 교환하고 매번 신선한 GM-CSF(50ng/mL)를 보충합니다.
2. electroporation 성분의 준비
참고: 이 프로토콜은 10μL-네온 팁(재료 표)용으로 설계되었습니다. 각 transfection에 대해 1-2 x 105 cells를 사용합니다. 형질주입된 세포를 48웰 플레이트 또는 8웰 챔버 접시(웰당 10μL-형질주입된 세포)에 시딩하는 것이 좋습니다. PBS 대신 1x 멸균 DPBS(Ca2+ 및 Mg2+ 제외)를 사용할 수 있습니다.
- 7일차에 RPMI-1640 배지에 FBS(10%(v/v)) 및 글루타맥스(2mM)를 보충하여 무항생제 배지를 준비합니다.
- 무혈청 RPMI-1640 배지, 트립신-EDTA(0.25%) 용액, 1x 멸균 PBS(Ca2+ 및 Mg2+ 제외) 및 1.1.2단계의 완전 배양 배지를 37°C 수조에 놓습니다.
- 바닥이 유리인 접시(컨포칼 현미경 검사용)를 사용하는 경우 접시를 poly-D-lysine hydrobromide로 코팅합니다.
- 챔버가 잘 있는 8개 접시에 200μL의 폴리-D-라이신 하이드로브로마이드(1x 멸균 PBS에서 0.1mg/mL)를 코팅하고 RT에서 5분 동안 배양합니다.
- poly-D-lysine 용액을 흡입하고 1x 멸균 PBS로 유리를 한 번 세척합니다. PBS를 흡인하고 2.4단계를 진행합니다.
- 48웰 플레이트 또는 8개의 웰 챔버 플레이트의 웰당 200μL의 무항생제 배지를 추가하고 형질주입된 세포를 플레이트화할 준비가 될 때까지 가습된 조직 배양 인큐베이터(37°C, 5% CO2)에서 사전 배양합니다.
3. electroporation를 위한 세포의 준비
참고: 7일의 분화 기간이 끝날 때 10cm 접시에서 MDM의 수율은 약 1.5 x 106 cells입니다. PBS 대신 1x 멸균 DPBS(Ca2+ 및 Mg2+ 제외)를 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 대부분의 대식세포가 세포 생존력과 무결성을 유지하면서 플레이트에서 분리되도록 최적화되었습니다. MDM은 세포 배양 플레이트에서 분리하기 어렵습니다. 따라서 세포를 해리하기 위해 3.2단계와 3.3단계를 두 번 수행해야 할 수도 있습니다. 트립신-EDTA(0.25%)를 사용한 각 배양 시간이 5분을 초과하지 않는지 확인합니다.
- 10cm 접시에서 완전히 분화된 대식세포의 배지를 흡인하고 따뜻한 무혈청 RPMI-1640 배지로 세포 단층을 세척합니다. 매체를 완전히 제거해야 합니다.
- 10cm 접시당 따뜻한 트립신-EDTA(0.25%) 용액 2mL를 첨가하여 세포를 채취하고 가습 조직 배양 인큐베이터(37°C, 5% CO2)에서 5분 동안 배양합니다.
- p1000 마이크로피펫을 사용하여 트립신-EDTA(0.25%) 용액을 전체 접시 영역에 걸쳐 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 세포 분리를 완료합니다. 1.1.2단계에서 5mL의 따뜻한 완전 배양 배지가 들어 있는 15mL 코니컬 튜브로 세포 현탁액을 옮깁니다.
- 접시를 명시야 현미경으로 가져가 다양한 시야에서 세포 분리를 확인합니다. 여전히 상당한 양의 셀이 연결되어 있는 경우 3.2-3.3단계를 반복합니다.
- RT에서 5분 동안 250 x g에서 세포 현탁액을 원심분리합니다.
- 배지를 흡인하고 37°C로 예열된 1x 멸균 PBS 10mL에 세포를 재현탁합니다. 20μL 부분 표본을 측정하여 혈구계를 사용하여 세포 수를 측정합니다.
- 의도한 transfection당 1-2 x 105 cell을 채취하여 15mL 튜브에 넣습니다. 예열된 1x 멸균 PBS로 최종 부피 15mL를 만듭니다. 250 x g에서 상온에서 5분 동안 원심분리기.
- PBS를 흡입하고 250 x g에서 1분 동안 원심분리기를 한 번 더 흡입합니다. p200 마이크로피펫을 사용하여 세포 펠릿에서 잔류 PBS를 제거합니다.
4. caspase BiFC 성분을 human monocyte-derived macrophage로 핵 형성
참고: 프로토콜의 이 섹션은 Neon Transfection System(Table of Materials)을 사용하여 수행됩니다. 이 프로토콜은 10 μL 네온 팁을 사용하여 1-2 x 105 세포를 transfection하는 단계를 간략하게 설명합니다(Table of Materials). 100μL 네온 팁을 사용하는 경우 그에 따라 확장하십시오. 세포를 재현탁액 R에 15분 이상 노출시키면 세포 생존율과 transfection 효율이 저하될 수 있으므로
피하십시오.
- 리포터 플라스미드(즉, 100ng/μL의 mCherry 또는 dsRedmito)를 뉴클레아제가 없는 물 또는 0.5x TE 버퍼에 희석하여 형질주입된 세포를 시각화합니다.
- caspase BiFC 플라스미드를 nuclease-free 물 또는 0.5x TE 완충액에 적절한 농도로 희석하여 플라스미드의 총 부피가 10μL의 총 transfection 부피의 30%를 초과하지 않도록 합니다(즉, C1 Pro-VC 300ng/μL 및 C1 Pro-VN 300ng/μL
).
- transfection당 1.5mL sterile microtube를 준비하고 적절한 양의 리포터 플라스미드(즉, 50ng 또는 0.5μL)와 caspase BiFC 플라스미드(즉, 300ng 또는 1μL의 C1 Pro-VC 및 300ng 또는 1μL의 C1 Pro-VN 절편)를 추가합니다. 마이크로튜브를 항상 후드에 보관하십시오.
- 피펫 스테이션, 장치, 팁, 전기천공관 및 피펫을 멸균 층류 후드에 넣습니다.
메모: 피펫 스테이션, 장치, 팁, electroporation 튜브 및 피펫은 Neon Transfection System에 포함되어 있습니다.
- 피펫 스테이션의 고전압 및 센서 커넥터를 제조업체의 지침에 따라 장치의 후면 포트에 연결합니다. 피펫 스테이션을 장치 가까이에 두십시오.
- 전원 코드를 후면 AC 콘센트에 연결하고 장치를 전기 콘센트에 계속 연결합니다. 전원 스위치를 눌러 장치를 켭니다.
- 장치가 켜져 있고 적절하게 연결되었을 때 표시되는 시작 화면에 transfection 매개변수를 입력합니다. 전압을 누르고 1000을 입력한 다음 Done를 눌러 전압을 1000V로 설정합니다. Width를 누르고 40을 입력한 다음 Done을 눌러 펄스 지속 시간을 40ms로 설정합니다. 마지막으로 # Pulses를 누르고 2를 입력한 다음 Done을 눌러 전기 펄스 수를 2로 설정합니다.
- electroporation tube(키트에 제공됨) 중 하나를 가져와서 RT에서 3mL의 electrolytic buffer E(10μL 팁용이며 키트에 제공됨)를 채웁니다. electroporation tube를 피펫 스테이션의 피펫 홀더에 삽입합니다. 튜브 측면의 전극이 안쪽을 향하고 튜브를 삽입할 때 딸깍 소리가 들리는지 확인하십시오.
- 3.8단계에서 세포 펠릿을 취하고 각 1-2 x 105 세포에 대해 10μL의 예열된 재부유 R 완충액(키트에 제공됨)을 추가합니다. p20 마이크로피펫으로 부드럽게 섞습니다. 4.3단계에서 설정한 각 튜브에 10μL의 세포 현탁액을 추가하고 p20 마이크로피펫으로 부드럽게 혼합합니다.
- 피펫을 잡고 두 번째 스톱의 푸시 버튼을 눌러 팁을 삽입합니다. 클램프가 팁에서 피스톤의 장착 스템을 완전히 집어 올리고 피펫의 상단 헤드에 틈이 관찰되지 않는지 확인하십시오.
- 샘플을 흡인하려면 피펫의 푸시 버튼을 첫 번째 스톱까지 누르고 세포/플라스미드 DNA 혼합물이 들어 있는 첫 번째 튜브에 담그십시오. 혼합물을 피펫 팁으로 천천히 흡인합니다.
메모: 기포는 electroporation 도중 호광을이루는 원인이 될 수 있고, 장치에 의해 검출되는 경우에, 전기 맥박의 납품을 방지할 수 있으므로 피하십시오. 기포가 관찰되면 내용물을 튜브에 넣고 다시 흡입해 보십시오.
- 샘플과 함께 피펫을 피펫 홀더에 매우 조심스럽게 삽입하십시오. 피펫이 딸깍 소리를 내며 제대로 배치되었는지 확인하십시오.
- 터치스크린에서 시작을 누르고 전기 펄스가 전달될 때까지 기다립니다. 화면에 완료를 나타내는 메시지가 표시됩니다.
- 스테이션에서 피펫을 천천히 제거하고 푸시 버튼을 첫 번째 정지 지점까지 천천히 눌러 2.4단계에서 예열된 무항생제 배지가 있는 해당 웰에 형질주입된 세포 현탁액을 즉시 추가합니다.
메모: 이 팁은 동일한 플라스미드에 대해 최대 3회까지 재사용할 수 있습니다. 그렇지 않으면 푸시 버튼을 두 번째 정지 지점까지 눌러 생물학적 위험 폐기물 용기에 버리십시오.
- 세포/플라스미드 DNA 혼합물을 포함하는 각 튜브에 대해 4.10-4.14단계를 반복합니다.
- 형질주입된 세포로 플레이트를 부드럽게 흔들고 가습된 조직 배양 인큐베이터(37°C, 5% CO2)에서 1-3시간 동안 배양합니다.
- 각 웰에 1.1.2단계에서 예열된 배양 배지(완전 배지) 200μL를 추가합니다. 접시를 가습 조직 배양 인큐베이터(37°C, 5% CO2)에 다시 놓습니다. 유전자 발현을 위해 최소 24시간을 허용합니다.
- 다음 날, 에피형광 현미경을 사용하여 세포 생존율과 transfection 효율을 검사합니다.
- 제조업체의 지침에 따라 epifluorescence microscope와 fluorescent light source box를 켜고 배양 접시를 microscope s에 놓습니다.tage.
- 10x 또는 20x 대물렌즈와 568nm(RFP) 필터를 선택합니다.
- 세포 생존율을 추정하려면 투과광 LED(TL) 버튼을 눌러 선택한 필드의 모든 세포를 시각화합니다. 현미경 접안렌즈를 들여다보면서 세포가 관찰될 때까지 초점 손잡이를 돌리고 선택한 필드에 세포가 부착되어 있는지 확인합니다.
메모: 완전히 부착된 셀은 실행 가능한 셀을 나타내고 부동 셀은 생존 불가능한 셀을 나타냅니다. 우물의 농도가 높으면 부착되지 않은 세포의 존재는 낮은 생존력의 결과가 아니라 세포 수의 과대 평가의 결과일 수 있습니다. 그러나 높은 부유 세포 함량을 동반하는 낮은 포화도는 전기천공법 중 아크, 플라스미드 독성 또는 재부유 R 완충액에 대한 과다 노출로 인해 발생할 수 있는 낮은 생존율을 의미합니다. 후자의 동작을 나타내는 우물을 사용하지 마십시오.
- transfection 효율을 추정하려면 위에서 설명한 대로 투과광 아래에서 선택한 field의 세포에 초점을 맞춥니다. 선택한 필드의 총 셀 수를 계산합니다. 투과광 LED(TL)가 꺼진 상태에서 반사광 LED 버튼(RL)을 눌러 켭니다.
- 리포터 유전자 형광(적혈구)에 세세하게 초점을 맞추고 적색 형광 세포의 총 수를 계산합니다. 웰당 두 개 이상의 필드에 대해 이 단계(4.18.4-4.18.5)를 반복합니다.
5. transfected MDM 및 caspase BiFC 데이터 수집 처리
참고: 에피형광 또는 컨포칼 현미경을 사용하여 세포를 이미지화하려는 경우, 카스파제 의존성 세포 사멸(주로 세포사멸)을 방지하기 위해 선택한 자극으로 치료하기 1시간 전에 qVD-OPh(20μM)로 처리하는 것이 좋습니다. 이는 세포가 세포사멸로 인해 이륙하는 것을 방지하기 위해 이미징에 사용되며, 세포가 초점면을 벗어날 때 이미징을 매우 어렵게 만듭니다. 활성화 플랫폼 및 관련 caspase BiFC에 대한 caspase 모집은 caspase의 촉매 활성에 의존하지 않으며, 결과적으로 caspase 억제는 이 단계에 영향을 미치지 않습니다.
- transfection 약 24시간 후에 선택한 자극으로 투여하고 각 약물에 필요한 만큼 인큐베이팅합니다.
- 1.1.2단계의 배양 배지에 Hepes(20mM, pH 7.2-7.5) 및 2-메르캅토에탄올(55μM)을 보충하여 이미징 배지를 준비합니다.
- 예열된 이미징 매체에 원하는 농도의 자극을 추가하고 부드럽게 혼합합니다.
- p1000 마이크로피펫으로 세포에서 배지를 조심스럽게 제거하고 5.1.2단계의 자극 용액 500μL를 웰 측면 아래로 추가합니다.
- 처리되지 않은 control well을 실행하려면 자극이 없는 이미징 매체를 추가합니다.
- 각 처리에 대해 지시된 기간 동안 가습된 조직 배양 인큐베이터(37 °C, 5% CO2)에서 세포를 배양합니다.
- epifluorescence 또는 confocal microscope를 사용하여 세포를 시각화합니다.
- 제조업체의 지침에 따라 현미경과 형광등을 켭니다.
- 10x 또는 20x 대물렌즈를 선택하고 배양 접시를 현미경 스테이지에 놓습니다.
- 현미경 접안렌즈를 사용하여 568nm 필터 아래에서 세포를 찾고 dsRedmito/mCherry 리포터(적색 세포)를 발현하는 세포에 초점을 맞춥니다.
- 시야에 있는 모든 빨간색 세포를 세고 숫자를 기록합니다.
- 동일한 시야에서 488 또는 512 필터(GFP 또는 YFP)로 변경하고 녹색(금성 양성 또는 BiFC 양성)인 빨간색 세포의 수를 세고 숫자를 기록합니다.
- 최소 3개의 개별 시야에서 최소 100개의 dsRedmito/mCherry 양성 세포를 계산합니다.
