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Visualization of Caspase Activation in Human Monocyte-Derived Macrophages

July 8th, 2025

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

출처: Bolívar, B. E., et. al., 인간 단핵구 유래 대식세포에서 염증성 카스파제 유도 근접성의 시각화. J. Vis. 특급 (2022).

이 비디오는 이분자 형광 보완 리포터 단백질을 사용하여 인간 대식세포에서 카스파아제 단백질의 활성화를 보여줍니다. 카스파제-1의 프로 도메인은 비너스 단백질의 비형광 단편과 융합되며, 이 단백질은 인플라마솜 복합체에 동원됩니다. 인플라마솜의 근접성은 금성 단편의 재접힘과 형광을 유도하여 대식세포에서 카스파아제 활성화를 확인합니다.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

인간 참가자와 관련된 모든 절차는 인간 복지를 위한 제도적, 국가적, 국제적 지침에 따라 수행되었으며 지역 기관 검토 위원회의 검토를 거쳤습니다.

1. 인간 단핵구의 분리 및 대식세포로의 분화

  1. 지역 혈액 은행에서 비식별화된 건강한 개인으로부터 항응고된 혈액을 얻고 아래와 같이 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 분리합니다.
    메모: 조직 배양 층류 후드에서 모든 단계를 수행합니다. 멸균 튜브만 사용하고 장갑을 착용하십시오. 폐기 시 모든 혈액 관련 제품에 10% 표백제를 첨가하십시오. 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)(1x) 또는 Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS)(Ca2+ 및 Mg2+ 제외)를 상호 교환하여 사용할 수 있습니다.
    1. 희석 완충액 준비: 1x 멸균 PBS에 2% 소 태아 혈청(FBS) 및 0.5mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)을 보충합니다.
    2. 배양 배지 준비: RPMI-1640 배지에 FBS(10%(v/v)), 글루타맥스(2mM) 및 페니실린/스트렙토마이신(50 I.U./50 μg/mL)을 보충합니다.
    3. 제조업체의 프로토콜에 ....

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
그림 1: 실험 워크플로우의 개략적 개요.

figure-results-2
그림 2: CD14-단핵구의 분화 및 인간 MDM의 transfection.(A) 분화 1일, 3일, 4일, 7일에 GM-CSF에 노출된 말초 혈액에서 CD14+ 단핵구의 대표적인 명시야 이미지(척도 막대, 100μm). (BC) human MDM은 caspase-1 pro-BiFC 쌍 및 transfection report.......

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
48웰 조직 배양2:34 플레이트제네시 사이언티픽25-108
10cm 조직 배양 접시폭스바겐제25382-166
2 메르캅토에탄올 1000x써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific21985023
1.5 HP 커버 글라스가 있는 8웰 챔버 커버 글라스셀비스c8-1.5H-N
AutoMACS 열Miltenyi (바이오텍)Tel.: 130-021-101AutoMACS Pro Separator를 사용한 자동 분리만 가능
AutoMACS Pro 분리기Miltenyi (바이오텍)Tel.: 130-092-545AutoMACS Pro Separator를 사용한 자동 분리만 가능
AutoMACS Pro 세척 솔루션Miltenyi (바이오텍)Tel.: 130-092-987AutoMACS Pro Separator를 사용한 자동 분리만 가능
AutoMACS 헹굼 솔루션Miltenyi (바이오텍)Tel.: 130-091-222AutoMACS Pro Separator를 사용한 자동 분리만 가능
버퍼를 실행하는 AutoMacMiltenyi (바이오텍)Tel.: 130-091-221QuadroMACS 또는 AutoMACS pro Separator를 사용한 수동 또는 자동 분리용
CSU-X1A 5000 회전 디스크 장치가 장착된 Axio Observer Z1 전동 도립 현미경자이스568nm(RFP) 및 488 또는 512nm(GFP 또는 YFP) 파장의 레이저 라인이 장착된 레이저 모듈이 장착된 모든 컨포칼 현미경을 사용할 수 있습니다.
AxioObserver A1, 연구용 도립 현미경자이스568nm(RFP) 및 488 또는 512nm(GFP 또는 YFP) 파장을 자극할 수 있는 형광 필터가 있는 모든 epifluorescence microscope를 사용할 수 있습니다
CD14+ 마이크로비즈Miltenyi (바이오텍)Tel.: 130-050-201QuadroMACS 또는 AutoMACS pro Separator를 사용한 수동 또는 자동 분리용
염화칼슘 및 염화마그네슘이 없는 DPBS시그마D8537-6x500ML
DsRed 미토 플라스미드클론텍632421형광 리포터로 사용할 수 있는 유사한 플라스미드는 Addgene에서 찾을 수 있습니다.
소 태아 세럼써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific10437028
피콜-팩 플러스 6 x 100 mL시그마GE17-1440-02
글루타맥스 보충제 (100x)써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific35050079
GM-CSF써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher ScientificPHC2011
Hemin BioXtra, 돼지, INSERT CHARACTR96.0%(HPLC)시그마51280-1지
헤페스써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific15630106
염증성 카스파제 BiFC 플라스미드LBH 연구소의 요청에 따라 사용 가능
LPS-EB 초순수인비보젠TLRL-3펠프스
LS 컬럼Miltenyi (바이오텍)Tel.: 130-042-401QuadroMACS 분리기를 사용한 수동 분리만 가능
MACS 15 mL 튜브 랙Miltenyi (바이오텍)Tel.: 130-091-052QuadroMACS 분리기를 사용한 수동 분리만 가능
MACS 멀티스탠드Miltenyi (바이오텍)Tel.: 130-042-303QuadroMACS 분리기를 사용한 수동 분리만 가능
mCherry 플라스미드Yungpeng Wang 연구실형광 리포터로 사용할 수 있는 유사한 플라스미드는 Addgene에서 찾을 수 있습니다.
Neon Transfection 시스템써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher ScientificMPK5000네온 electroporation 장치, 피펫 및 피펫 스테이션 포함
Neon Transfection System 10 μL 키트써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher ScientificMPK1096재현탁액 R, 재현탁액 T, 전해 완충액 E, 96 x 10 μL 네온 팁 및 네온 전기천공관 포함
니게리신 나트륨 염, 기성품 용액시그마SML1779-1ML
페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/mL)써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific15140122
Poly-D-Lysine 하이드로 브로마이드시그마P7280-5mg
QuadroMACS 분리기Miltenyi (바이오텍)Tel.: 130-090-976QuadroMACS 분리기를 사용한 수동 분리만 가능
qVD-OPh피셔(ApexBio)Tel.: 50-101-3172
RPMI 1640 미디엄써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific11875119
트립신-EDTA (0.25%), 페놀 레드써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific25200072
울트라퓨어 0.5 m EDTA, pH 8.0써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific15575020
년 호 ) ) ) ) ) ) ) ) ) ) )

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Caspase ActivationHuman MacrophagesBimolecular Fluorescence ComplementationInflammasome ComplexEpifluorescence MicroscopyLipopolysaccharide TreatmentNigericin StimulusVenus Protein ReporterCaspase 1 Pro domainTransfection Protocol

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