숙주-미생물총(Microbiota) 상호작용을 연구하기 위한 생체 외 장기 배양 시스템

초록

출처: Azriel, S., et al. 숙주-미생물총(microbiota) 상호작용을 분석하기 위한 장내 장기 배양 시스템. J. Vis. 특급 (2021).

이 비디오에서는 쥐의 장 조직 조각과 특정 장내 세균 간의 상호 작용을 연구하기 위해 생체 외 장 장기 배양 시스템을 설정하는 방법론을 설명합니다. 이 장치는 두 쌍의 입력-출력 포트로 구성되며, 첫 번째는 장 조직 내강을 연결하고 특정 박테리아 현탁액을 공급하고, 두 번째는 생체 외 조직 생존력을 유지하기 위해 장치의 웰에 매체를 지속적으로 공급합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 실험 준비

1. 장기배양장치 제작 (3일)
   1. 3D 프린터를 사용하여 장기 배양 장치(장치에는 24개의 크고 작은 구멍이 있는 6개의 우물과 장치 덮개 뚜껑이 있음)용 재사용 가능한 플라스틱 금형을 인쇄합니다.
      참고: 이러한 플라스틱 금형은 수많은 장치 제조에 사용할 수 있습니다.
   2. 뭉툭한 바늘(22G 및 18G)을 장치 금형 내의 적절한 위치에 삽입하고 장치와 뚜껑 한 세트에 대해 약 20g의 폴리디메틸실록산(PDMS) 혼합물(1:10 중량 비율, 베이스와 촉매)을 주조합니다.
   3. 금형을 진공 챔버에 30분 동안 넣어 PDMS 혼합물에서 기포를 제거합니다.
   4. 금형을 55°C에서 하룻밤 동안 배양하여 PDMS 중합을 완료합니다.
   5. PDMS가 설정되면 금형에서 바늘을 빼내고 플라스틱 금형에서 배양 장치와 뚜껑을 조심스럽게 분리합니다.
   6. 수술용 칼날을 사용하여 웰 윤곽에서 PDMS 잔류물을 제거합니다. 무독성 실리콘 접착제를 사용하여 PDMS 장치와 장치 덮개를 커버 유리(75mm x 50mm 마이크로 슬라이드)에 부착하고 부품을 밤새 굳힌 상태로 둡니다(장치의 부드러운 면에 접착제를 바릅니다).
   7. 내강에 22G 바늘 12개를 삽입하고 웰에 18G 바늘 12개를 삽입합니다. 실리콘을 사용하여 모든 바늘을 제자리에 고정하고 밤새 굳힙니다. 18G 바늘 2개를 커버 뚜껑에 삽입하여 장 장기 배양 장치 안팎으로 적절한 공기 흐름을 돕습니다.
   8. 물이 채워진 주사기를 사용하여 모든 바늘에 누출이 있는지 확인하십시오. 우물에 물을 채워 우물에서 누수가 없는지 확인하십시오.
   9. 결장에 연결될 각 22G 바늘에 두 개의 수술 매듭을 놓습니다. 장치와 뚜껑을 오토클레이브 종이 봉지에 넣고 오토클레이브에서 살균합니다.
2. 배양 매체(0.5시간)
   1. 생물학적 후드에서 다음을 혼합합니다(50mL 튜브 내). Iscove의 IMDM(Modified Dulbecco's Medium) 37mL, KSR 혈청 대체체 10mL, B27 보충제 1mL, N2 보충제 0.5mL, 1M HEPES 완충액 0.5mL 및 비필수 아미노산 0.5mL
   .
   2. 전체 매체를 여과하고 4°C에서 보관합니다.
3. 튜빙 및 수술 도구 준비
   1. 입력 루멘, 입력 웰, 출력 루멘 및 출력 웰(12개의 짧은 튜브 및 12개의 긴 튜브)에 대해 적절한 길이의 튜브를 자릅니다. 튜브의 양쪽에 적절한 어댑터를 연결합니다.
   2. 수술 도구를 준비하십시오 : 직선 가위, 4x 얇은 집게 및 2x 날카로운 집게.
   3. 튜브와 수술 도구를 오토클레이브 종이 봉지에 넣고 오토클레이브를 사용하여 살균합니다.
4. 내강 입력(원하는 자극 - 박테리아, 대변, 약물 등)을 준비합니다.
   1. 실험하기 전에 연속 희석을 통해 박테리아 배양의 박테리아 부하를 측정하고 호기성 및/또는 혐기성 조건에서 배양합니다.
   2. 박테리아 부하를 계산한 후 멸균 조직 배양 배지에서 박테리아 배양액을 희석하여 필요한 박테리아 농도를 얻습니다. 배설물 샘플의 경우 100μm 스트레이너를 사용하여 필터링합니다.
      메모: 비박테리아 자극(약물, 대사 산물 등)의 경우 장 배양 배지를 사용하여 물질을 필요한 농도로 희석합니다.

2. 실험 설정 준비

1. 장기 배양 인큐베이터 내부에서 히터 유닛을 켜고 37°C로 설정합니다.
2. 펌프와 입력 및 출력 주사기를 설정합니다.
3. 조직 배양 배지 투입
   1. 생물학적 또는 층류 후드에서 투입 웰 주사기를 완전한 배양 배지로 채웁니다. 최종 부피는 실험 기간과 유속에 따라 다릅니다. 일반적으로 1mL/h와 퍼지를 위한 추가 매체가 있습니다.
   2. Luer-lock 어댑터를 사용하여 튜브를 주사기에 연결합니다. 채워진 주사기를 주사기 펌프에 놓습니다.
   3. 입력 주사기를 퍼팅합니다. 웰 매체가 모든 튜브에서 폐 유리로 흘러 나오는지 확인하십시오.
4. 루미널 입력
   1. 발강 입력 주사기를 자극 처리(박테리아, 약물 등)로 채웁니다. 부피는 실험 기간과 유속(일반적으로 30μL/h와 퍼지를 위한 추가 매체)에 따라 다릅니다.
   2. Luer-lock 어댑터를 사용하여 튜브를 주사기에 연결합니다. 채워진 주사기를 주사기 펌프에 놓습니다.
   3. 입력 주사기를 퍼지합니다. 자극이 모든 튜브에서 폐유리로 흘러 들어가는지 확인하십시오. 다양한 자극을 오염시키지 않도록 주의한다.
5. 출력
   1. 출력 주사기 펌프에 빈 주사기를 놓습니다(펌프 모드를 '인출'로 설정).
6. 장치 설정
   1. 부드럽고 최소한의 흐름을 위해 가스 혼합물(95% O₂ + 5% CO₂) 유량을 제어하는 조절기를 설정합니다.
   2. 층류 후드에서 장치를 검사하십시오.
   3. 멸균 IMDM으로 장치의 바늘을 세척하여 바늘을 씻으십시오.
   4. 500μL의 멸균 배양 배지를 장치의 각 웰에 추가합니다.
7. 조직 해부를 위한 준비
   1. 멸균 수술 도구를 층류 후드 안에 넣습니다.
   2. 10mL 주사기에 멸균 IMDM을 채우고 멸균(오토클레이브) 22G 뭉툭한 끝 바늘을 연결하여 결장을 세척합니다.

3. 장기 배양

1. 생쥐 희생 및 조직 해부
   1. 층류 후드에서 12일에서 14일 된 생쥐를 참수하여 희생합니다. 생쥐에게 70% 에탄올을 뿌리고 생쥐를 플라스틱 접시에 놓습니다.
   2. 날카로운 가위와 집게를 사용하여 쥐를 해부하고 모든 지방과 결합 조직을 잘라 위에서 항문까지 소화관을 꺼냅니다. 결장을 잘라 새 접시에 놓습니다.
      메모: 결장 조직과의 접촉을 최소화하십시오. 결장 조직의 중간 부분을 만지지 마십시오. 티슈를 부드럽게 잡고 티슈의 가장자리만 잡으십시오.
2. 결장 세척 및 세척
   1. 해부 현미경으로 준비된 10mL 주사기로 멸균 IMDM(근위부로)으로 결장 내용물을 부드럽게 세척합니다(2.7.2단계). 장 조직에서 대변을 제거한 후 0.5mL의 멸균 IMDM으로 채워진 새로운 6웰 플레이트에 결장을 놓습니다.
3. 장치에 콜론 연결
   1. 티슈를 가져다가 22g 바늘에 조심스럽게 연결하고 두 개의 실로 단단히 묶습니다. 이 시점에서, 결장이 내강 흐름에 대한 올바른 방향을 유지하는 것이 필수적입니다(근위 = 입력, 원위 = 출력). 6개의 조직 모두에 대해 3.2-3.3단계를 반복합니다.
   2. 입력 바늘 Luer 잠금 장치가 매체에서 비어 있는지 확인합니다. 그렇지 않은 경우 비우십시오. 입력 바늘 Luer 잠금 장치에 자극을 추가합니다(기포가 루멘으로 들어가는 것을 방지하기 위해). 적절한 자극으로 각 결장에 대해 이 단계를 반복합니다.
   3. 모든 티슈가 연결되어 있는지 확인하고 장치 위에 덮개 덮개를 놓습니다.
4. 장기 배양 장치를 펌프에 연결
   1. 장치를 예열된 온도 제어 챔버(37°C)에 놓습니다.
5. 가스 흐름 연결
   1. 적절한 입력 바늘을 사용하여 가스 어댑터를 덮개 덮개에 연결합니다.
   2. 입력 및 출력 튜브를 장치에 연결합니다.
      메모: 근위 결장 쪽을 입력 튜브에 연결합니다.
6. 자극 입력으로 루멘을 퍼지합니다.
   1. 장을 통해 내강 자극이 부드럽게 흐르게 하고 출력 튜브의 매체 흐름을 확인합니다.
   2. 외부 매체를 세척하십시오.
   3. 외부 매체를 3회 세척합니다(입력 및 출력 웰 모두에 대해 600μL/min의 속도로 펌프를 설정). 각 세척에는 1분이 걸립니다(우물을 비우는 것부터 시작).
7. 실험을 시작합니다.
   1. 다음 속도로 펌프를 시작하십시오.
      유량: 루멘: 입력- 30 μL/h, 출력- 35 μL/h
      외부 매체: 입력- 1000 μL/h, 출력- 950 μL/h
      메모: 실험 시간은 30분에서 24시간 사이로 다양할 수 있습니다.
8. 실험 종료(결장 장기 배양의 경우 최대 24시간)
   1. 장치에서 모든 튜브를 분리합니다.
   2. 바늘에서 조직을 분리하고 원하는 판독을 계속합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
장치
18게이지 무딘 바늘	맥마스터	제75165A754
22게이지 무딘 바늘	맥마스터	제75165A758
다목적 접착 실란트 100% 실리콘	댁	688
큐빅 진공 데시케이터 VDC-21+ 2 선반		AAAD4021
유리 슬라이드 1mm 두께	코 닝	2947-75X50
미니 인큐베이터 im-10		AAH24315K
MPC 301E 진공 펌프		VI-412711
플라스틱 퀵 턴 튜브 커플 링 플러그	맥마스터	51525케이121
플라스틱 퀵 턴 튜브 커플 링 소켓	맥마스터	52525케이211
Sylgard 184 실리콘 엘라스토머	다우		폴리디메틸실록산, PDMS
배관	맥마스터	6516T11
조트랙스 M200	조르트랙스		Zortrax Z-SUITE, 오토데스크 Fusion 360
Zortrax M200 재료: Z-ultrat	조르트랙스
보통
B27 보충제 (50개), 무세럼 T	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	17504044
Iscove의 변형된 Dulbecco's 페놀 레드 미디엄 (1x)	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	12440061
HEPES 버퍼 (1M)	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	15630056
넉아웃 세럼	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	10828028
N2 보충제 (100개)	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	A1370701
비필수 아미노산(100x)	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	11140035
수술 도구
큰 가위	아셀텍	11-00-10
샤프 펜치	F.S.T	11297-10
실크 꼰 수술 실	에스엠아이	8010지
스트레이트 가위	F.S.T	14091-09
얇은 집게	F.S.T	11051-10
오르간 시스템
0.1 μm 필터	생명 유전자
0.22μm 필터	생명 유전자
5mL Luer-Lock 주사기	B-D	309649
Greenough 스테레오 현미경	자이스	스테미 305
순환 정밀 에어 히터 "CUBE"		큐브-2-LIS
주사기 펌프	뉴 에라 펌프 시스템 Inc	NEP-NE-1600-엠

호 호 의 ) ) ) ) ) ) 일 년 년 년