세포 내 염색 및 유세포 분석을 통한 사이토카인 생산에 대한 담배 제품 제제의 효과 분석

초록

출처: Arimilli, S. et al., 가연성 담배 제품 제제의 세포 독성 및 면역 억제를 평가하는 방법.J. Vis. 특급(2015년)

이 비디오는 유세포 분석을 사용하여 담배 제품 제제(TPP)가 인간 말초 혈액 단핵 세포의 사이토카인 생산에 미치는 영향을 보여줍니다. TPP로 세포를 처리하면 전염증성 사이토카인의 생성을 하향 조절하며, 이는 지질다당류 자극 후 추정된 후 면역염색 및 유세포 분석 분석이 수행됩니다.

프로토콜

인간 참가자와 관련된 모든 절차는 인간 복지를 위한 제도적, 국가적, 국제적 지침에 따라 수행되었으며 지역 기관 검토 위원회의 검토를 거쳤습니다.

1. WS-CM 준비

1. 앞에서 설명한 대로 전체 연기 조절 매체(WS-CM)를 생성합니다.
   다음
   1. 흡연 요법을 사용하여 페놀이 빨간색이 없는 Roswell Park Memorial Institute(RPMI) 1640 매체를 통해 4개의 3R4F 참조 담배에서 연기를 통과시켜 WS-CM을 준비합니다: 35-60-2, 분첩 부피(ml), 분원 간격(초) 및 분원 기간(초). 각 준비는 20ml 샘플을 생성합니다.
2. 튜브에 완료 날짜, 시간, 담배 이름 및 번호를 표시합니다. 500 μl의 분취액은 흡연이 완료된 직후 -80 °C에서 보관하십시오.
3. 앞서 설명한 바와 같이 니코틴, 담배 특이적 니트로사민 및 다환 방향족 탄화수소의 수준을 결정하기 위해 동결된 WS-CM의 부분 표본을 분석합니다.

2. 말초 혈액 단핵 세포, PBMC의 분리

1. 건강한 기증자(담배 제품을 소비하지 않는 사람)로부터 신선한 혈액을 수집합니다.아래 설명된 대로 신선한 혈액에서 PBMC를 분리합니다.
   1. 혈액 주머니가 도착하기 전에 500ml 병, 가위, 분리 완충액 및 Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS)(RT)를 생물안전 레벨 2(BSL-2) 세포 배양 후드에 준비합니다. 절연 버퍼는 빛으로부터 보호되어야 합니다.
   2. 혈액 주머니를 거꾸로 잡고 클램프가 삽입된 곳 바로 아래에 있는 튜브를 자르고 튜브를 최소 3cm 남겨둡니다.
   3. 500ml 병의 뚜껑을 제거하고 병 입구 위에 튜브를 잡습니다. 혈액 주머니를 집어 들고 거꾸로 뒤집어 주머니가 비워질 때까지 혈액이 주머니에서 병으로 자유롭게 흐를 수 있도록 합니다. 거품이 생기지 않도록 혈액이 병의 내벽으로 흐르도록 하십시오.
   4. 분리 완충액과 혈액의 1:5 비율로 분리 완충액을 병에 붓습니다. 병의 뚜껑을 단단히 닫고 끝에서 끝까지 10회 부드럽게 뒤집습니다. 용기를 세포 배양 후드에 넣어 불을 끈 상태에서 RT에서 1시간 동안 배양합니다.
   5. 옅은 밀짚 색의 층이 혈액 위에 쌓일 것입니다. 25ml 혈청 피펫을 사용하여 50ml 원뿔형 튜브에 넣으십시오. 수거된 양은 헌혈한 피험자에 따라 50 - 300ml까지 다양할 수 있습니다.
   6. 실온에서 10분 동안 200 x g에서 튜브를 원심분리합니다.
   7. 반투명 상층액을 흡인하여 어두운 핏빛 알갱이를 남깁니다. 펠릿은 느슨하지만 점성이 있습니다.
   8. 3ml의 분리 버퍼를 15ml 원뿔형 튜브에 피펫으로 넣습니다.
   9. 재현탁된 펠릿에 2.1.5단계에서 수집된 밀짚 색 액체 50ml당 DPBS 20ml를 추가합니다. Vortex는 완전히 혼합하고 여러 튜브에서 재현탁된 액체를 통합합니다. 이 액체에는 부유 혈액 세포가 포함되어 있습니다.
   10. 전사 피펫을 사용하여 2.1.8단계에서 부유 혈액 세포 5ml를 3ml의 분리 완충액으로 옮깁니다. 세포 현탁액이 들어 있는 15ml 원뿔형 튜브를 천천히 부드럽게 기울여 두 개의 별도 층을 만듭니다. 400 x g에서 RT에서 40분 동안 브레이크 없이 최소한의 가속으로 튜브를 원심분리합니다.
   11. 전사 피펫을 사용하여 PBMC를 포함하는 흐린 중간층(버피 코트)을 50ml 원뿔형 튜브로 제거합니다. 그 아래에 다른 명확한 레이어를 그리지 마십시오. 각 25ml 원추형 튜브에 50ml 이하로 옮기십시오.
   12. 25ml의 냉간 실행 버퍼(또는 50ml 원뿔형 튜브의 남은 전체 부피를 채우기 위해 그 이상)를 추가하여 세포를 세척합니다. 400 x g에서 4°C에서 10분 동안 셀을 원심분리합니다.
   13. 10ml 러닝 버퍼로 펠릿을 재현탁합니다. 여기에는 PBMC가 포함되어 있습니다. 세포를 세어 즉시 사용하거나 얼음 위에 올려 얼립니다.

3. PBMC 동결 및 해동

1. 2.1.13단계에서 수집한 eripheral blood mononuclear cells(PBMC)를 400 x g에서 10분 동안 원심분리합니다.
2. 제조업체의 지침에 따라 냉동 용기에 이소프로필 알코올을 채웁니다.
   주의: 이소프로필 알코올은 가연성이며 급성 독성이 있습니다.
3. 20% 소 태아 혈청(FBS) 및 10% 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 함유한 RPMI 1640 배지(4°C)로 펠릿을 재현탁합니다. 이것은 RPMI 1640 냉동 매체입니다. 펠릿을 일정 양의 동결 매체로 재현탁시키면 약 5 x 10⁷ cells/ml의 현탁액이 생성됩니다. 동결에 사용할 수 있는 셀의 수는 다양합니다.
4. 세포 현탁액 1ml를 2ml cryotube에 분주하고 cryotube를 냉동 용기에 넣습니다. 냉동 튜브가 든 냉동 용기를 -80°C의 냉동고에 넣어 O/N을 저장한 다음 냉동 튜브를 제거하고 -150°C에서 -190°C 사이의 극저온 냉동고에 보관합니다.
5. 극저온 저장소에서 cryotube를 제거하고 37°C의 수조에서 부드럽게 교반하여 빠르게 해동합니다.
6. 동결관에서 해동된 PBMC를 10% FBS, 1% Pen/Strep 및 1% L-glutamine을 포함하는 10ml RPMI 1640 완전 배지(4°C)가 있는 15ml 원뿔형 튜브로 즉시 옮깁니다. 해동된 극저온 튜브의 내용물은 최대 세포 생존력을 얻기 위해 가능한 한 빨리 옮겨야 합니다.
7. PBMC를 400 x g에서 10분 동안 원심분리합니다.
8. 펠릿을 5ml RPMI 1640 complete medium으로 재현탁하고 세포를 계수합니다.
9. 트리판 블루 배제법(trypan blue exclusion method)과 같은 확립된 방법으로 세포 생존율을 측정합니다. 일반적으로 이 방법의 세포 생존율은 약 90 - 95%입니다. 이제 PBMC를 실험에 사용할 준비가 되었습니다.

4. 세포 내 염색 및 유세포 분석

참고: 여기에 나열된 희석액은 이 연구의 목적을 위한 것입니다. 그에 따라 희석량을 조정할 수 있습니다.

1. RPMI 완전 배지를 사용하여 0.3, 1.56, 3 및 5μg/ml의 등니코틴 단위 농도에서 총 부피 100μl/웰까지 96웰 플레이트에서 WS-CM을 희석합니다.
2. 동일한 플레이트에서 니코틴을 2, 10, 50, 100, 500, 2000 및 4000 μg/ml.
   농도로 희석합니다. 주의: 니코틴은 독성이 강하고 환경적으로 위험합니다.
3. RPMI 완전 배지에 1 × 10⁶ cells/well의 농도로 현탁 PBMC 100 μl를 추가합니다. 세포와 WS-CM 또는 니코틴의 총 부피는 200μl/well입니다.
4. 플레이트를 덮고 37°C 및 5% CO₂에서 3시간 동안 배양합니다.
5. 300 × g에서 3분 동안 원심분리하여 상층액을 흡인하고 플레이트를 덮은 상태에서 플레이트 바닥을 볼텍싱하고 마지막으로 200μl의 얼음처럼 차가운 완충액으로 세포를 재현탁시켜 RT에서 세포를 세척하고 세척 단계를 한 번 더 반복합니다.
6. 200μl의 RPMI 완전 배지를 플레이트에 추가하고 세척 단계를 한 번 더 반복합니다.
7. RPMI 완전 배지를 사용하여 2 μl/ml GolgiPlug 및 10 μg/ml LPS의 작업 농도를 준비하고 각 웰에 200 μl를 추가합니다.
8. 플레이트를 37 ° C 및 5 % CO₂에서 6 시간 동안 배양합니다.
9. 9.8 단계가 끝나면 러닝 버퍼(4 °C)로 셀을 세척하고 300 x g에서 4 °C에서 3분 동안 회전합니다.
10. 각 웰에 100μl의 Cytofix를 추가하고 4°C에서 20분 동안 배양합니다.
11. 9.9단계에서 설명한 대로 300 x g에서 4°C에서 3분 동안 1x Permwash(4°C)로 셀을 3회 세척합니다.
12. 각 웰에 45μL의 1x Cytoperm을 추가한 다음 TNF-α-Alexa Fluor 488, IFN-γ V500, MIP-1α PE 항체 중 하나 각각을 5μl씩 추가합니다. 4 °C에서 30 분 동안 배양하십시오.
13. 9.9단계에서 설명한 대로 1x Permwash(4°C)로 셀을 두 번 세척하고 300 x g에서 4°C에서 3분 동안 러닝 버퍼(4°C)로 한 번 세척합니다.
14. 200μl의 2% 파라포름알데히드(4°C)로 세포를 재현탁합니다. 세포를 12 × 75 mm 튜브로 옮기고 유세포 분석기에서 샘플을 분석합니다.
    주의: 파라포름알데히드는 부식성, 급성 독성 및 건강에 해롭습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
12 X 75 튜브	BD 팔콘	352058
15ml 원뿔형 튜브	코 닝	제430790
2 mL 마이크로튜브	액시겐	MCT-150-C-S
3R4F 참고 담배	켄터키 대학교 농업 대학	3R4층
50ml 원뿔형 튜브	코 닝	430828
500ml 병	코 닝	430282
96웰 플랫 바텀 플레이트	테르모 눙	439454
세포 배양 후드	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	1300 시리즈 A2
원심 분리기	에펜도르프	58110R
Cytofix/Cytoperm (펌워시)	BD 바이오사이언스	555028	가연성
FBS(증권 시세	시그마-알드리치	F2442
필터 유닛	날진	제156-4020
유세포 분석기	BD 바이오사이언스	FACS 칸토 II	Ex 405 및 Em785에서 8가지 색상.
유세포 분석기	BD 바이오사이언스	FACS 칼리버	Ex 495 및 Em 785에서 4가지 색상.
유세포 분석 소프트웨어	트리 스타	플로우조
냉동 용기	날진	5100-0001	DMSO 함유, 자극성
Gogli플러그	BD 바이오사이언스	555029	발암 물질, 자극성, 부식성
IFN-γ V-500 항체	BD 호라이즌	561980	피부 감작제
절연 버퍼	아이소림프, CTL 사이언티픽 코퍼레이션	1114868	인화성 액체, 자극성
이소프로필 알코올	시그마-알드리치	W292907
L-글루타민	Gibco Life 기술	제25030-081
증권 시세	시그마-알드리치	L2630
MIP1-α PE 항체	BD 파밍겐	554730	급성 독성, 경구
니코틴	시그마-알드리치	N3876	급성 독성, 환경 유해
파라필름	베미스	"엠"
파라포름알데히드	시그마-알드리치	P6148	인화성, 피부 자극성
펜/연쇄상 구균	Gibco Life 기술	15140-122
RPMI 1640	Gibco Life 기술	11875-093
실행 중인 버퍼	MACS 러닝 버퍼, Miltenyi Biotech	Tel.: 130-091-221
TNF-α Alexa Fluor 488 항체	바이오레전드	502915
이송 피펫	피셔 사이언티픽	Tel.: 13-711-20

호 크 ) 표시기 호 호 표시기 (영문) 년 년 년