황색포도상구균(Staphylococcus aureus)에 의한 체외 생물막 합성(In vitro Biofilm Synthesis)

초록

출처: Rana, P. S. et al., 인간 호중구와 황색포도상구균 생물막 간의 상호 작용을 시각화하고 정량화하기 위한 표준화된 체외 분석. J. Vis. 특급. (2022년)

이 비디오에서는 폴리-L-라이신으로 코팅된 멀티웰 플레이트에서 S. aureus에 의한 체외 생물막의 준비를 보여줍니다. 생물막 형성된 플레이트는 다운스트림 실험에 사용할 수 있습니다.

프로토콜

1. 체외 생물막 제조

1. Tryptic Soy Agar와 같은 영양이 풍부한 한천 플레이트에서 줄무늬 플레이트 기술을 사용하여 냉동 보존된 스톡에서 분리된 S. aureus 콜로니를 얻습니다(재료 표 참조).
2. 96웰 플레이트의 개별 웰을 멸균 H₂O에 희석된 100μL의 0.001%(v/v) 폴리-L-라이신(PLL)으로 코팅하고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 무균적으로 진공 보조 흡인 트랩을 사용하여 PLL 용액을 흡인합니다. 우물을 실온에서 밤새 건조시키십시오.
   메모: 프로토콜의 모든 흡인 단계는 달리 명시되지 않는 한 진공 보조 흡인 트랩을 사용하여 수행됩니다.
3. 2% 포도당이 보충된 MEMα(minimal essential media alpha)에 S. aureus 콜로니를 접종하여 하룻밤 배양을 준비하고 37°C에서 200rpm으로 16-18시간 동안 진탕하여 배양합니다.
4. 50 μL를 2 % 포도당이 보충 된 신선한 MEMα 5 mL로 옮겨 하룻밤 배양을 희석하고 37 ° C에서 200 rpm으로 진탕하여 일반적으로 0.5-0.8의 광학 밀도 600 (OD_600nm) 사이의 중간 대수 단계까지 배양합니다. MEMα를 사용하여 중간 로그 배양을 OD_600nm 0.1로 정규화합니다.
5. 150μL의 정규화된 배양물을 PLL 처리된 96웰 플레이트의 각 웰로 옮깁니다. 37 ° C의 가습 챔버에서 18-20 시간 동안 정적으로 배양하십시오 .
   메모: 생물막은 또한 μ채널 슬라이드와 같은 다른 형식으로 성장할 수 있습니다(재료 표 참조).
6. 플랑크톤 세포를 제거하기 위해 상등액을 흡인합니다. 150μL의 Hanks' Balanced Salt Solution(HBSS)으로 남은 바이오매스를 부드럽게 세척하여 부착되지 않은 세포를 제거합니다. HBSS를 드롭와이즈로 추가하여 생물막을 방해하지 않도록 합니다.
   메모: 세척하는 동안 상층액과 HBSS를 흡인하는 동안 생물막이 계속 잠길 수 있도록 생물막이 포함된 웰에 충분한 액체(상층액 또는 HBSS)만 남겨둡니다. 이는 HBSS가 바이오필름을 세척하기 위해 적가적으로 첨가될 때 바이오필름 구조의 붕괴를 방지합니다.
7. 1.6단계를 두 번 이상 반복하여 모든 플랑크톤 세포를 제거합니다. 이 시점에서 생물막은 즉각적인 다운스트림 실험을 할 준비가 되었습니다.
   메모: 생물막이 호중구 실험에 사용되지 않는 경우 HBSS를 인산염 완충 식염수(PBS)로 대체할 수 있습니다. HBSS는 포도당을 포함한 호중구 활성화를 위한 최적의 조건을 제공하는 성분을 함유하고 있기 때문에 PBS보다 선호됩니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
BD Bacto 트립틱 소이 브로스	BD (영어)	DF0370-07-5	1.5% 한천과 결합하여 Tryptic Soy 한천을 만드세요
투명 바닥 96웰 평평한 바닥 폴리스티렌 플레이트	코스타	3370
행크스의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS) 1x	코닝 cellgro	21-022-이력서	칼슘, 마그네슘, 페놀 레드가 없습니다.
Poly-L-lysine 용액	시그마	P4707-50ML
백색의 불투명 96웰 플레이트	송골매	353296	조직 배양 처리 및 평평한 바닥 플레이트
최소 필수 매체(MEM) 알파 1x	지브코	41061-029

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