황색포도상구균(Staphylococcus aureus)에 의한 체외 생물막 합성(In vitro Biofilm Synthesis)

1. 체외 생물막 제조

1. Tryptic Soy Agar와 같은 영양이 풍부한 한천 플레이트에서 줄무늬 플레이트 기술을 사용하여 냉동 보존된 스톡에서 분리된 S. aureus 콜로니를 얻습니다(재료 표 참조).
2. 96웰 플레이트의 개별 웰을 멸균 H₂O에 희석된 100μL의 0.001%(v/v) 폴리-L-라이신(PLL)으로 코팅하고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 무균적으로 진공 보조 흡인 트랩을 사용하여 PLL 용액을 흡인합니다. 우물을 실온에서 밤새 건조시키십시오.
   메모: 프로토콜의 모든 흡인 단계는 달리 명시되지 않는 한 진공 보조 흡인 트랩을 사용하여 수행됩니다.
3. 2% 포도당이 보충된 MEMα(minimal essential media alpha)에 S. aureus 콜로니를 접종하여 하룻밤 배양을 준비하고 37°C에서 200rpm으로 16-18시간 동안 진탕하여 배양합니다.
4. 50 μL를 2 % 포도당이 보충 된 신선한 MEMα 5 mL로 옮겨 하룻밤 배양을 희석하고 37 ° C에서 200 rpm으로 진탕하여 일반적으로 0.5-0.8의 광학 밀도 600 (OD_600nm) 사이의 중간 대수 단계까지 배양합니다. MEMα를 사용하여 중간 로그 배양을 OD_600nm 0.1로 정규화합니다.
5. 150μL의 정규화된 배양물을 PLL 처리된 96웰 플레이트의 각 웰로 옮깁니다. 37 ° C의 가습 챔버에서 18-20 시간 동안 정적으로 배양하십시오 .
   메모: 생물막은 또한 μ채널 슬라이드와 같은 다른 형식으로 성장할 수 있습니다(재료 표 참조).
6. 플랑크톤 세포를 제거하기 위해 상등액을 흡인합니다. 150μL의 Hanks' Balanced Salt Solution(HBSS)으로 남은 바이오매스를 부드럽게 세척하여 부착되지 않은 세포를 제거합니다. HBSS를 드롭와이즈로 추가하여 생물막을 방해하지 않도록 합니다.
   메모: 세척하는 동안 상층액과 HBSS를 흡인하는 동안 생물막이 계속 잠길 수 있도록 생물막이 포함된 웰에 충분한 액체(상층액 또는 HBSS)만 남겨둡니다. 이는 HBSS가 바이오필름을 세척하기 위해 적가적으로 첨가될 때 바이오필름 구조의 붕괴를 방지합니다.
7. 1.6단계를 두 번 이상 반복하여 모든 플랑크톤 세포를 제거합니다. 이 시점에서 생물막은 즉각적인 다운스트림 실험을 할 준비가 되었습니다.
   메모: 생물막이 호중구 실험에 사용되지 않는 경우 HBSS를 인산염 완충 식염수(PBS)로 대체할 수 있습니다. HBSS는 포도당을 포함한 호중구 활성화를 위한 최적의 조건을 제공하는 성분을 함유하고 있기 때문에 PBS보다 선호됩니다.