병원성 박테리아를 통해 림프구를 자극하는 체외 기술

초록

출처: Dousha, L., et al. 헤모필루스 인플루엔자에 대한 호흡기 면역 반응 평가. J. Vis. 특급 (2021년)

이 비디오는 유형이 불가능한 헤모필루스 인플루엔자(NTHi)를 통해 림프구를 자극하고 면역 반응을 평가하는 체외 기술을 보여줍니다. NTHi와 함께 분리된 말초혈액 단핵세포(PBMC)를 배양하면 박테리아 세포가 T 림프구를 자극하여 사이토카인 생성을 유도합니다. 사이토카인의 분비를 억제하면 면역형광 염색을 수행하여 자극된 T 림프구에 축적된 세포 내 사이토카인을 검출합니다.

프로토콜

1. 항원 제제

참고: Hi에 대한 면역 반응을 평가하기 위해 세 가지 다른 항원 제제를 사용할 수 있습니다. 이들은 1) 세포 내 구성 요소(일반적으로 박테리아 세포벽에서); 2) 죽고 비활성화 된 박테리아; 3) 살아있는 박테리아. 실험을 시작하기 전에 각 항원 제제의 사용을 결정합니다.

1. Subcellular 구성 요소
   1. 상업적 제제, 자체 개발 구성 요소 및/또는 다른 연구자를 포함한 출처에서 세포 내 구성 요소를 얻습니다.
      메모: 일반적으로 박테리아 세포벽에서 유래하는 세포 내 구성 요소가 사용될 수 있으며 여기에는 P6 및 리풀리고당(LOS)과 같은 외막 단백질이 포함됩니다. 이러한 세포 내 구성 요소는 일반적으로 전문 센터에서 파생됩니다. 그것들이 어떻게 만들어지는지에 대한 설명은 이 기사의 범위를 벗어납니다. 이러한 구성 요소를 얻으려면 이 분야의 전문가와 직접 연락하는 것이 좋습니다.
2. 죽임/불활성화되는 박테리아
   1. 적절한 샘플(예: 가래 또는 기관지 내시경 검사)에서 박테리아를 얻습니다. 적절한 미생물학 실험실을 통해 균주가 H. influenzae인지 확인합니다. H. influenzae 샘플의 타이핑을 수행하여 타입이 불가능한지 확인합니다(NTHi, 전문 미생물학 실험실).
   2. 대표적인 항원을 얻으려면 여러 NTHi 균주(각각 거의 동일한 양인 최소 5개)를 사용하여 통합 항원을 만듭니다. 균주를 마이크로 원심분리기 튜브의 글리세롤 육수에 -70°C에서 보관하십시오.
      메모: 이 실험에서는 10개의 서로 다른 균주가 사용되었습니다.
   3. 균주(한 번에 하나의 마이크로 원심분리기 튜브)를 초콜릿 한천 플레이트에 해동하고 37% CO₂가 포함된 2°C 인큐베이터에서 밤새 자랍니다. 500μL의 인산염 완충 식염수(PBS)에 박테리아를 넣고 두 번 세척합니다(300 x g에서 5분 동안 회전). MacFarland 표준 또는 분광 광도계를 사용하여 NTHi를 10^8mL 농도로 분주합니다(5mL 용기 또는 이에 상응하는 경우 사용).
   4. 박테리아를 56°C의 수조에 10분 동안 넣어 가열하여 박테리아를 비활성화합니다.
   5. 30초 동안 중저가 범위에서 낮은 범위의 속도로 연속 초음파 설정을 사용하여 박테리아를 초음파 처리합니다.
   6. 적절한 양의 샘플을 마이크로 원심분리기 튜브에 분취합니다. 10^8mL 샘플의 경우 50μL의 부분 표본(즉, mL당 20개 샘플)을 사용하고 필요할 때까지 -70°C에서 동결합니다.
3. 살아있는 박테리아
   1. 먼저 1.2.1단계에서 언급한 대로 살아있는 박테리아를 특성화합니다. 잘 특성화된 균주 하나를 사용합니다. 균주가 -70°C의 글리세롤 육수에 예비로 저장되어 있는지 확인하십시오.
   2. 박테리아는 초콜릿 한천 플레이트와 같은 농축 매체 또는 육수에서 성장합니다.
      1. 초콜릿 한천 플레이트를 사용하려면 멸균 스프레더로 최소 3-4일마다 박테리아를 퍼뜨립니다.
      2. 또는 인자 X(헤민)와 V(β-니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드)가 풍부한 뇌 심장 주입(BHI) 육수를 사용하여 박테리아를 성장시킵니다. 헤민과 β-니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(둘 다 10μg/mL)가 모두 보충된 5-10mL의 BHI 육수에 밤새 플레이트에서 NTHi를 접종하고 5% CO₂ 인큐베이터에서 37°C에서 밤새 배양합니다.
         메모: 이는 재현성, 더 높은 집락 형성 단위(CFU) 수, 모든 박테리아가 유사한 통나무 성장 단계에 있다는 장점이 있습니다(플레이트에서 박테리아 생존력은 배양액의 위치에 따라 더 클 수 있음).
   3. 한 세포에 100개 박테리아의 MOI(Multiplicity of Infection)를 사용하여 세포 생존력을 유지하면서 강력한 면역 반응을 유도합니다. MacFarland Standard 또는 분광 광도계를 사용하여 박테리아의 수를 평가합니다.
   4. 살아있는 NTHi 분석에 사용되는 배지에 인체 혈청이 없는지 확인하면 박테리아가 죽을 수 있습니다. 동물 혈청 샘플(예: 태아 송아지 혈청)은 일반적으로 문제를 일으키지 않습니다.
      메모: 아래 설명된 방법을 사용하여 말초 혈액, 기관지 내시경 샘플(특히 기관지폐포 세척(BAL)) 및 절제된 폐 조직과 같은 표준 조직 샘플을 분석합니다. Hi 항원으로 샘플을 10분에서 24시간 또는 그 이상 배양합니다.

2. 말초 혈액의 림프구 기능 평가

1. 유세포 분석 분석을 위해 전혈 또는 단핵 세포 전제를 사용합니다.
2. 정맥 천자로 각 피험자에서 샘플을 획득합니다. 리튬 헤파린 튜브의 말초 정맥에서 혈액 4mL를 수집하고 제어 및 항원 자극을 위해 샘플을 부분 표본으로 나눕니다.
3. 두 검체에 공동자극 항체(anti-CD28 및 CD49d, 1 μL/mL)를 추가합니다. 항원 샘플에 NTHi를 첨가하고 37 ° C 및 5 % CO₂에서 1 시간 동안 배양합니다. 사멸된 NTHi 제제의 경우 혈액 2mL에 항원 200μL를 첨가합니다. 살아있는 NTHi의 경우 100:1의 MOI로 살아있는 NTHi 세포를 백혈구계에 추가합니다(혈구계로 측정).
4. Golgi 차단제 Brefeldin A(10 μL/mL)를 샘플에 추가하고 5 h.
   동안 추가로 배양합니다. 메모: 골지체를 막으면 사이토카인이 세포 밖으로 내보내는 것을 방지할
수 있습니다.
5. 전혈을 사용하는 경우 적혈구를 0.8% 염화암모늄으로 용해하여 용액에 백혈구만 남깁니다. 500μL의 1%-2% 파라포름알데히드를 사용하여 1시간 동안 백혈구를 고정합니다.
6. 혈구계로 세포를 계수하고, 100 μL의 0.1% 사포닌으로 15분 동안 투과화하고, 세포에 형광 표지 항체를 배양합니다. 세포를 세척하고 유세포 분석기를 사용하여 분석합니다.
   메모: 형광 표지 항체의 양은 각 사이토카인에 대해 특이적입니다. 제조업체의 지침을 따릅니다. 일반적으로 100μL 용액에 있는 10개의⁶개 세포가 1시간 동안 염색됩니다. 상업적으로 얻어진 대부분의 항체는 25-100회의 검사를 수행하기에 충분합니다.
7. 그림 1과 같이 관련 림프구 집단(세포는 CD45, CD3, 나중에 CD4 또는 CD8 발현에 의해 게이트됨)을 게이팅하여 항원 반응 세포의 비율을 결정합니다. 분석할 모든 사이토카인에 대해 자극되지 않은 세포에 대해 배경 염색을 수행합니다. 100,000개의 세포를 스크리닝하여 자극된 세포와 대조군 모두에 대해 각 사이토카인을 분석합니다.

결과

그림 1: 폐 조직의 사이토카인 생성. 먼저 유세포 분석을 사용하여 백혈구 마커 CD45(A)의 발현을 분석합니다. 그런 다음 이 모집단을 CD3 발현(B) 및 CD4/CD8 발현(C)에 대해 추가로 분석합니다. CD3/CD4+ 세포는 대조군(D) 및 NTHi 자극 샘플(E)에서 세포 내 사이토카인 생산에 대해 평가됩니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
염화암모늄	시그마 알드리치	213330
브레펠딘	시그마 알드리치	B6542
CD28	써모피셔	Tel.: 16-0289-81
CD49d	써모피셔	534048
사포닌	시그마 알드리치	8047152