$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
인간 참가자와 관련된 모든 절차는 인간 복지를 위한 제도적, 국가적, 국제적 지침에 따라 수행되었으며 지역 기관 검토 위원회의 검토를 거쳤습니다.
1. 항원 제제
- 살아있는 박테리아
- 먼저 살아있는 박테리아를 특성화합니다. 적절한 샘플(예: 가래 또는 기관지 내시경 검사)에서 박테리아를 얻습니다. 적절한 미생물학 실험실을 통해 균주가 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae)인지 확인합니다. H. influenzae 샘플의 타이핑을 수행하여 타이핑할 수 없는지 확인합니다(전문 미생물학 실험실에 의해). 잘 특성화된 균주 하나를 사용합니다. 균주가 -70°C의 글리세롤 육수에 예비로 저장되어 있는지 확인하십시오.
- 박테리아는 초콜릿 한천 플레이트와 같은 농축 매체 또는 육수에서 성장합니다.
- 초콜릿 한천 플레이트를 사용하려면 멸균 스프레더로 최소 3-4일마다 박테리아를 퍼뜨립니다.
- 또는 인자 X(헤민)와 V(β-니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드)가 풍부한 뇌 심장 주입(BHI) 육수를 사용하여 박테리아를 성장시킵니다. 헤민과 β-니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(둘 다 10μg/mL)가 보충된 5-10mL의 BHI 육수에 하룻밤 플레이트에서 비유형 H. 인플루엔자(NTHi)를 접종하고 5% 이산화탄소, CO2 인큐베이터에서 37°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
메모: 이는 재현성, 더 높은 집락 형성 단위(CFU) 수, 모든 박테리아가 유사한 통나무 성장 단계에 있다는 장점이 있습니다(플레이트에서 박테리아 생존력은 배양액의 위치에 따라 더 클 수 있음).
- 한 세포에 100개 박테리아의 MOI(Multiplicity of Infection)를 사용하여 세포 생존력을 유지하면서 강력한 면역 반응을 유도합니다. MacFarland Standard 또는 분광 광도계를 사용하여 박테리아의 수를 평가합니다.
- 살아있는 NTHi 분석에 사용되는 배지에 인체 혈청이 없는지 확인하면 박테리아가 죽을 수 있습니다. 동물 혈청 샘플(예: 태아 송아지 혈청)은 일반적으로 문제를 일으키지 않습니다.
참고: 아래 설명된 방법을 사용하여 말초 혈액, 기관지 내시경 샘플(특히 기관지폐포 세척(BAL)) 및 절제된 폐 조직과 같은 표준 조직 샘플을 분석합니다. Hi 항원으로 샘플을 10분에서 24시간 또는 그 이상 배양합니다.
2. 폐 조직의 림프구 기능/염증 매개체 평가
- 일반적으로 기관지경검사에서 충분한 림프구를 얻을 수 없습니다.따라서 폐엽 절제술 샘플에서 폐 조직을 사용하십시오. 폐 조직 샘플을 최적화하려면 해부병리학 서비스와의 긴밀한 연락이 필요합니다. 조직이 종양에서 최소 3cm의 여백을 가지고 있고 심각한 폐기종이 없는 세포 조직인지 확인합니다(병리학자의 결정에 따름).
- 유세포 분석 분석에 사용하기 전에 폐 조직을 세포 현탁액으로 분해합니다. 폐 조직을 화학적으로(예: 콜라겐 분해 효소) 소화하거나 기계적으로 분해합니다.
메모: 조직의 기계적 분해는 세포의 더 나은 표면 염색(예: CD3/4 라벨링)과 관련되어 있기 때문에 선호될 수 있습니다.
- 병리학자로부터 폐엽 절제술 샘플을 얻습니다(일반적으로 폐암 치료를 받는 환자에게서 얻음). 약 20-40g의 샘플을 3-5mm3 섹션으로 자릅니다. 멸균 50μL 챔버 내부에 넣은 후 적절한 disaggregator를 사용하여 기계적으로 단편화합니다.
- 조직 분해 후, 0.8% 염화암모늄(150mM 염화암모늄(NH4Cl), 1 mM 중탄산나트륨(NaHCO3) 및 0.1 mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 용액의 10:1(즉, 5mL)로 적혈구를 용해합니다.
메모: 대안적으로, Q-prep과 같은 자동화 시스템을 사용할 수 있다.
- 멸균 RPMI에 세포를 재현탁한 다음(부피는 세포 수에 따라 다르며 일반적으로 10-20mL임) 100μm 멸균 나일론 메쉬를 통해 여과합니다. trypan blue exclusion 방법을 사용하여 생존 가능한 세포의 수를 계산합니다.
3. NTHi 감염 분석
- 폐 세포를 튜브당 4 x 106 cells/mL의 최종 세포 농도로 재현탁합니다(대조군 및 자극된 샘플).
- (음성) 대조관에 대해 RPMI 1mL에 4 x 106-6 x 106 세포의 현탁액을 사용합니다. NTHi 튜브에 동일한 양을 사용하십시오(추가 샘플은 포도상구균 초항원 E(SEB)와 함께 양성 대조군으로 사용할 수 있음). 세포당 100개의 박테리아의 MOI로 NTHi 튜브의 세포를 감염시킵니다. 튜브에서 가스가 전달될 수 있도록 캡을 반 바퀴 풉니다.
- 세포를 튜브 로테이터에 넣고 12rpm으로 회전하면서 37°C에서 배양합니다.
- 사이토카인의 세포 외 유입을 방지하기 위해 자극 1시간 후 세포 현탁액에 골지 차단제(Brefeldin A)를 최종 농도 10μg/mL로 추가합니다. 교대 시 16-22시간 추가 배양을 위해 세포 현탁액을 반환합니다.
- 1% 소 혈청 알부민(BSA)과 0.01% 아지드화나트륨, NaN3를 함유한 500μL의 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포 현탁액을 세척합니다.
- 세포 내 사이토카인 염색을 위한 항체를 추가합니다(항체 선택은 연구자가 결정해야 함). 특정 인간 림프구 세포 표면 마커(예: CD45, CD3 등)에 대한 세포 현탁액을 1시간 동안 염색합니다. PBS로 세포를 씻고 고정하고 투과시킵니다.
- 500μL의 1%-2% 파라포름알데히드를 사용하여 1시간 동안 세포를 고정합니다.
- 혈구계로 세포를 계수하고, 100 μL의 0.1% 사포닌으로 15분 동안 투과화하고, 세포에 형광 표지 항체를 배양합니다. 세포를 세척하고 유세포 분석기를 사용하여 분석합니다.
메모: 형광 표지 항체의 양은 각 사이토카인에 대해 특이적입니다. 제조업체의 지침을 따릅니다. 일반적으로 100μL 용액에 있는 10개의6개 세포가 1시간 동안 염색됩니다. 상업적으로 얻어진 대부분의 항체는 25-100회의 검사를 수행하기에 충분합니다.
- 세포를 세포 내 사이토카인 염색 항체(예: 인터페론-감마, IFN-γ 및 종양괴사인자 베타, TNF-α 또는 인터루킨, IL-13 및 IL-17A)로 1시간 동안 배양합니다.
메모: 먼저 표면 마커를 염색한 다음 세포 내를 고정하면 항체가 결합하는 표면 단백질에 구조적 변화를 일으킬 수 있으므로 염색하는 것이 좋습니다.
- 500 μL의 PBS로 세포를 세척하고 100 μL의 PBS에 재현탁시킨 후 유세포 분석기에서 데이터를 획득합니다.