Opsonized Biofilm과의 상호 작용에 따른 호중구에 의한 ROS 생산 측정

초록

출처: Rana, P. S. J. B., et al. 인간 호중구와 황색포도상구균 생물막 간의 상호 작용을 시각화하고 정량화하기 위한 표준화된 체외 분석. J. Vis. 특급 (2022)

이 비디오에서는 옵소니화된 박테리아 생물막에 노출되었을 때 호중구에 의한 활성 산소 종의 생성을 감지하는 체외 화학발광 분석을 시연합니다.

프로토콜

1. 호중구에 의해 생성된 ROS 측정

1. 세척된 생물막에 100μL의 20% 정상 인간 혈청(HBSS로 희석)을 적가하고 30분 동안 정적 조건에서 37°C에서 배양하여 생물막을 옵소니화합니다.
2. 20% 혈청 용액을 흡입하고 150μL의 HBSS로 바이오필름을 한 번 적방울 세척합니다. HBSS를 흡인하여 옵소니화된 생물막이 있는 우물을 남겨둡니다.
   메모: 실험의 해석을 위해 (A) 호중구 + 생물막, (B) 호중구 + PMA(양성 대조군, 재료 표 참조), (C) 호중구만 및 (D) 생물막만 해당의 최소 4개 그룹이 권장됩니다.
3. 최종 루미놀 농도가 50μM가 되도록 4 x 10⁶ cells/mL의 농도로 HBSS에 재현탁된 호중구에 루미놀(재료 표 참조)을 추가합니다. 이 솔루션은 그룹 (A) 및 (C)에 사용할 준비가 되었습니다. 루미놀과 혼합된 4 x 10⁵ 호중구를 opsonized 생물막이 있는 웰에 추가합니다.
4. 별도의 튜브에서 호중구 없이 HBSS에서 50μM 루미놀 용액을 준비하고 이를 웰이 포함된 생물막(그룹 D)에 첨가합니다.
5. 루미놀과 혼합된 호중구 350μL를 분취하고 혼합물에 최종 농도 500ng/mL의 phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA)를 첨가합니다. 그룹 (B)의 경우, 이 혼합물의 4 x 10⁵ 호중구를 생물막이 없는 웰에 추가합니다. 이것은 포지티브 컨트롤 역할을 합니다.
   메모: 이 단계에서 표시된 PMA의 농도는 PMA로 자극된 호중구가 양성 대조군이므로 강력한 파열 반응을 보장하기 위해 상대적으로 높습니다. PMA는 실험에 따라 호중구를 활성화하기 위해 더 낮은 농도에서 사용할 수 있습니다.
6. 270 x g에서 4°C에서 30초 동안 플레이트를 원심분리합니다.
7. 플레이트 리더가 37°C로 설정되어 있는지 확인하고 60분 간격으로 3분 동안 발광 및 운동 판독 설정을 확인합니다. 플레이트 리더에 플레이트를 놓고 60분 동안 호중구에 의한 ROS 생산을 측정합니다
   메모: 이 분석을 위해 발광 분석에 사용되는 흰색 플레이트에서 생물막을 성장시켰습니다. PMA는 산화 버스트 반응에 대한 알려진 작용제입니다. PMA와 관련된 연구를 수행할 때는 PMA가 즉시 파열 반응을 시작하므로 호중구가 포함된 용액이 차가워진 상태에서 마지막 단계에서 PMA를 첨가해야 합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
50 mL 코니컬 원심분리기 튜브	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	339652
알코올 면봉	BD (영어)		채혈에 사용
셀 계수기	발 공급	202씨
투명 바닥 96웰 평평한 바닥 폴리스티렌 플레이트	코스타	3370
둘베코의 인산염 완충 식염수(DPBS) 1x	지브코	14190-144
행크스의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS) 1x	코닝 cellgro	21-022-이력서	칼슘, 마그네슘, 페놀 레드가 없습니다.
혈구계	브라이트 라인
루미놀	시그마	A8511-5G
최소 필수 매체(MEM) 알파 1x	지브코	41061-029
노멀 휴먼 세럼	보완 기술	보 건국
페트리 접시 (100 x 15mm)	폭스바겐	25384-342
Phorbol 12- 미리 스테이트 13- 아세테이트
Poly-L-lysine 용액	시그마	P4707-50ML
SoftMax Pro 소프트웨어	분자 장치		데이터 수집에 사용되는 마이크로플레이트 리더 소프트웨어
스펙트라맥스 i3x	분자 장치		마이크로플레이트 리더

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