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1. 체외 생물막 제조
- Tryptic Soy Agar와 같은 영양이 풍부한 한천 플레이트에서 줄무늬 플레이트 기술을 사용하여 냉동 보존된 스톡에서 분리된 S. aureus 콜로니를 얻습니다(재료 표 참조).
- 96웰 플레이트의 개별 웰을 멸균 H2O에 희석된 100μL의 0.001%(v/v) 폴리-L-라이신(PLL)으로 코팅하고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 무균적으로 진공 보조 흡인 트랩을 사용하여 PLL 용액을 흡인합니다. 우물을 실온에서 밤새 건조시키십시오.
메모: 프로토콜의 모든 흡인 단계는 달리 명시되지 않는 한 진공 보조 흡인 트랩을 사용하여 수행됩니다.
- 2% 포도당이 보충된 MEMα(minimal essential media alpha)에 S. aureus 콜로니를 접종하여 하룻밤 배양을 준비하고 37°C에서 200rpm으로 16-18시간 동안 진탕하여 배양합니다.
- 2% 포도당이 보충된 신선한 MEMα 50μL를 5mL로 옮기고 37°C에서 200rpm으로 진탕하여 일반적으로 0.5-0.8의 광학 밀도 600(OD600nm) 사이에서 중대수 단계까지 배양하여 하룻밤 배양을 희석합니다. MEMα를 사용하여 중간 로그 배양을 OD600nm0.1로 정규화합니다.
- 150μL의 정규화된 배양물을 PLL 처리된 96웰 플레이트의 각 웰로 옮깁니다. 37 ° C의 가습 챔버에서 18-20 시간 동안 정적으로 배양하십시오 .
메모: 생물막은 또한 μ채널 슬라이드와 같은 다른 형식으로 성장할 수 있습니다(재료 표 참조).
- 플랑크톤 세포를 제거하기 위해 상등액을 흡인합니다. 150μL의 Hanks' Balanced Salt Solution(HBSS)으로 남은 바이오매스를 부드럽게 세척하여 부착되지 않은 세포를 제거합니다. HBSS를 드롭와이즈로 추가하여 생물막을 방해하지 않도록 합니다.
메모: 세척하는 동안 상층액과 HBSS를 흡인하는 동안 생물막이 계속 잠길 수 있도록 생물막이 포함된 웰에 충분한 액체(상층액 또는 HBSS)만 남겨둡니다. 이는 HBSS가 바이오필름을 세척하기 위해 적가적으로 첨가될 때 바이오필름 구조의 붕괴를 방지합니다.
- 1.6단계를 두 번 이상 반복하여 모든 플랑크톤 세포를 제거합니다. 이 시점에서 생물막은 즉각적인 다운스트림 실험을 할 준비가 되었습니다.
메모: 생물막이 호중구 실험에 사용되지 않는 경우 HBSS를 인산염 완충 식염수(PBS)로 대체할 수 있습니다. HBSS는 포도당을 포함한 호중구 활성화를 위한 최적의 조건을 제공하는 성분을 함유하고 있기 때문에 PBS보다 선호됩니다.
2. 호중구 분리
참고: 호중구는 이전에 발표된 방법에 따라 약간의 변경으로 분리되었습니다. 이 분리 프로토콜은 먼저 밀도 구배 원심분리를 결합한 다음 3% 덱스트란 침강을 결합합니다. 이 섹션에서는 전체 호중구 분리 프로토콜만 다루며, 발표된 프로토콜의 변경 사항에 초점을 맞춥니다. 또한, 아래에 요약된 프로토콜은 호중구를 분리할 수 있는 많은 방법 중 하나이며 필요에 따라 대체할 수 있습니다. 호중구를 분리하는 다른 방법에는 세포 분리 매체 또는 자기 항체 세포 분리의 사용이 포함됩니다.
- 기관 IRB에 설명된 프로토콜에 따라 정맥 천자를 통해 성인 기증자로부터 혈액을 채취합니다. 채혈 전에 주사기에 방부제가 없는 헤파린이 충분히 함유되어 있어 헤파린의 최종 농도가 20U/mL가 되도록 합니다.
- 헤파린화된 혈액을 실온에서 H2O에 endotoxin-free 0.9% NaCl(재료 표 참조)의 3/4 부피로 희석합니다.
- 희석된 혈액 샘플 20mL마다, 새로운 50mL 원뿔형 튜브에 시판되는 밀도 구배 배지(재료 표 참조) 14mL를 분취합니다. 밀도 구배 매체 위에 희석된 혈액 샘플을 조심스럽게 겹쳐 놓습니다.
- 층상 혈액 샘플을 400 x g으로 실온에서 40분 동안 원심분리합니다. 원심분리가 완료되면 층을 방해하지 않도록 원심분리기가 천천히 끊어지는지 확인하십시오.
메모: 혈액 샘플에는 식염수와 혈장이 혼합된 5개의 층, 단핵 세포층, 밀도 구배 매질, 호중구 및 적혈구 가 있습니다.
- 혈청학적 피펫을 사용하여 호중구와 적혈구 펠릿 위의 모든 층을 흡인한 다음 H2O에서 차가운 내독소가 없는 0.9% NaCl에서 펠릿을 부드럽게 재현탁합니다. 20mL 혈액 샘플에서 생성된 각 펠릿에 대해 펠릿을 총 20mL 부피로 다시 현탁시킵니다. 1:1 부피의 3% 덱스트란을 추가합니다(재료 표 참조). 얼음 위에서 18-20분 동안 튜브를 똑바로 세웁니다.
메모: 3% 덱스트란이 H2O에 내독소가 없는 0.9% NaCl로 만들어졌는지 확인합니다.
- 호중구와 일부 적혈구가 포함된 상층의 20mL를 새로운 50mL 원뿔형 튜브에 제거하고 355 x g에서 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다.상등액을 붓고 빨간색 펠릿을 남깁니다.
- 펠릿을 10mL의 차갑고 멸균된 H2O에 30초 동안 부드럽게 재현탁시켜 남아 있는 적혈구를 용해합니다. 즉시 혼합물에 차가운 내독소가 없는 0.9% 식염수 10mL를 첨가하여 긴장도를 회복합니다. 용액을 233 x g에서 4°C에서 3분 동안 원심분리합니다.
- 상등액을 붓고 혈액 샘플 20mL당 1mL 차가운 HBSS에 95%-97% 호중구가 포함된 펠렛을 재현탁합니다.
- 10μL의 0.4% 트리판 블루 배제 염료 90μL에 재현탁된 호중구 10μL를 옮기고 혈구계를 사용하여 세포를 계수합니다(재료 표 참조).
메모: trypan blue exclusion dye는 생존 가능한 세포에서 투과되지 않기 때문에 생존 불가능한 세포는 파란색으로 염색됩니다. 이 프로토콜은 >99%의 세포 생존율을 제공합니다.
- 호중구의 최종 농도가 4 x 106 cells.
가 되도록 HBSS를 추가합니다.
메모: 예를 들어 세포 생존율이 <99%인 경우 4 x 106 cells/mL의 최종 농도를 계속 달성할 수 있습니다. 그러나, 얻어진 4 x 106 cells/mL를 포함하는 용액의 총 부피는 감소할 것이다. 호중구의 최종 농도는 사용자의 실험적 필요에 따라 조정할 수 있습니다. 호중구는 아래에 설명된 모든 실험에 대해 4 x 106 cells/mL 최종 농도로 재현탁되었습니다. 기증자 간 변동성을 설명하기 위해, 호중구와 관련된 모든 실험은 최소 3명의 다른 공여자와 함께 수행할 것을 강력히 권장합니다.
3. 생물막-호중구 상호 작용 이미징
- 1.2-1.6 단계를 사용하여 생물막을 설정합니다. 생물막 이미징을 용이하게 하려면 녹색 형광 단백질(GFP)을 발현하는 USA300과 같은 S. aureus의 형광 균주를 사용하여 현미경 이미징의 용이성을 높입니다.
메모: 시험관 내 생물막 모델(1단계)을 입증하기 위해 96웰 플레이트 대신 6 μ채널 슬라이드(재료 표 참조)를 사용했습니다.
- 호중구 4 x 106 cells/mL를 100μM의 Blue CMAC(7-amino-4-chloromethylcoumarin) 염료(BCD, 재료 표 참조)와 함께 37°C 및 5% CO2의 로커에서 30분 동안 배양합니다. 샘플이 어두운 곳에서 배양되었는지 확인하고 나머지 단계에서는 빛에 대한 노출을 제한합니다.
- 과도한 BCD를 세척하려면 270 x g에서 5분 동안 호중구를 원심분리하고 상층액을 흡인합니다. 호중구를 신선한 HBSS에 재현탁시킵니다. 이 시점에서 호중구 및 박테리아의 사멸을 모니터링하기 위해 BCD 염색 호중구에 에티듐 호모디머-1(재료 표 참조)을 최종 농도 4μM로 첨가합니다.
- μ-slides에서 성장한 S. aureus 생물막에 150μL의 호중구를 추가하여 호중구 대 박테리아 비율이 1:30(호중구: 박테리아)이 되도록 합니다. μ-슬라이드를 가습된 챔버에서 30분 동안 배양합니다. 박테리아 세포의 수는 18시간 생물막을 도금하여 얻은 세포 수를 기반으로 합니다.
- 형광 염료/단백질의 여기 파장 및 방출 파장에 해당하는 형광 채널을 사용하여 호중구-생물막 상호 작용을 이미지화합니다.
메모: 본 연구에서 BCD는 353/466 nm, 에티듐 호모다이머-1은 528/617 nm, GFP는 395/509 nm입니다. 샘플의 광표백을 방지하기 위해 샘플의 레이저 또는 빛에 대한 노출을 제한하십시오.
- 현미경 이미지 분석 소프트웨어 또는 FIJI/ImageJ, COMSTAT2, BiofilmQ 및 BAIT와 같은 프로그램을 사용하여 이미지를 분석합니다.
메모: 얼룩으로 작업할 때 사용 중인 염료의 특이성을 고려하는 것이 중요합니다. 일부 염색은 원핵 및 진핵 세포에 작용하는 반면 다른 염색은 하나에만 작용합니다. 호중구와 생물막을 두 세포 유형을 모두 염색할 수 있는 염료를 사용하여 별도로 염색하는 경우, 교차 염색을 방지하기 위해 호중구와 생물막을 결합하기 전에 남아 있는 염료를 씻어내야 합니다.