결장 조직 절편의 면역조직화학적 분석을 통한 화학적 유발 대장염 평가

초록

출처: Du, Y. W. et al., 염증성 장 질환 마우스 모델에서 장 염증에 대한 미각 신호 단백질 폐지의 효과.J. Vis. 특급(2018년)

이 비디오는 마우스 결장 조직의 면역조직화학적 염색을 통한 화학적 유발 대장염의 평가를 보여줍니다. 염색된 조직 절편에서 손상된 조직에 많은 수의 면역 반응 세포가 존재한다는 것은 대장염 중 면역 세포의 침투를 나타냅니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 마우스와 DSS의 준비

1. 녹아웃(α-gustducin^-/-) 마우스와 연령, 성별 및 체중이 일치하는 야생형 대조군(α-gustducin^+/+) C57BL/6 마우스를 깨끗한 케이지에 개별적으로 보관하십시오.
   메모: 녹아웃 마우스는 20세대 이상 동안 C57BL/6 마우스와 역교배되었으며 거의 100% C57BL/6 유전적 배경을 가지고 있습니다.
2. 30g의 덱스트란 설페이트 나트륨(DSS) 분말을 1L의 고압증기멸균수에 녹입니다. 용액이 투명해질 때까지 혼합하여 최종 작업 농도가 3%(w/v).
   이 되도록 합니다. 메모: DSS 솔루션은 최대 1주일 동안 실온에서 보관하거나 사용할 때까지 4°C에서 보관할 수 있습니다.

2. 생쥐의 DSS 대장염 유도 및 평가

1. 각 마우스의 초기 체중을 측정하고 기록합니다. 마우스를 표준 플라스틱 케이지에 개별적으로 넣고 케이지에 라벨을 붙입니다.
2. 일반 식수를 총 7일 동안 3% DSS 용액으로 교체하여 두 그룹의 마우스 모두 자유자재로 사용할 수 있습니다.
3. 마우스의 체중을 측정하고, DSS 용액 소비량을 기록하고, DSS 투여 기간 동안 매일 각 마우스의 대변을 수집 및 검사합니다. 설사 및 직장 출혈의 중증도를 관찰하고 이를 DSS 유발 질환 지수로 변환합니다.
4. 실험 중에 초기 체중 대비 체중 감소율과 질병 지수를 계산하여 대장염의 증상을 평가합니다.
   메모: 질병 지수는 설사와 직장 출혈에 대한 관찰을 결합하여 점수가 매겨지며 0(정상 대변, 혈액 없음), 1(부드러운 대변, 혈액 없음), 2(부드러운 대변, 혈액 적음), 3(매우 부드러운 대변, 경미한 출혈) 및 4(물변, 상당한 출혈)로 정의됩니다. 질병 지수는 각 마우스에 대해 매일 분석됩니다.
5. 7일간의 DSS 치료가 끝날 때까지 경추 탈구로 마우스를 희생하고 나머지 실험을 진행합니다.

3. 조직 샘플의 준비

1. 마우스를 누운 자세로 놓고 70 % 에탄올로 복부 피부를 청소합니다. 작은 가위로 복부를 3cm 길이의 정중선 절개하여 복강을 노출시킵니다.
2. 집게를 사용하여 비장을 다른 조직과 조심스럽게 분리한 다음 비장을 제거하고 크기를 측정합니다.
3. 집게로 결장을 확인하고 들어 올려 주변 장간막과 분리합니다. 맹장과 직장이 보일 때까지 결장 전체를 당겨 빼냅니다.
4. 대장 가장자리와 골반 깊숙한 곳에서 결장을 횡절하여 결장을 분리하여 각각 근위 및 원위 결장을 해제합니다. 그런 다음 분리된 결장의 길이를 측정하고 기록합니다. 절제 과정에서 결장 조직이 손상되지 않도록 주의하십시오.
간침이
5. 장착된 10mL 주사기로 얼음처럼 차가운 인산염 완충 식염수(PBS) 10mL로 결장을 세척하여 용출액이 완전히 투명해질 때까지 대변과 혈액을 제거합니다.
6. 조직학적 식별을 위해 조직 샘플을 근위부, 중간부, 원위부의 세 부분으로 균등하게 나눕니다. 그런 다음 4°C에서 밤새 4% 파라포름알데히드(PFA)로 조직을 고정합니다.
7. 사이토카인 발현을 분석하기 위해서는 결장 전체를 액체 질소로 급속 동결하고 사용할 때까지 -80°C에서 보관합니다.

4. DSS로 인한 대장염의 중증도에 대한 조직학적 평가

1. 면역조직화학(Immunohistochemistry)
   1. 고정 후 조직을 15mL 튜브에 1x PBS의 30% 자당 용액에 하룻밤 동안 담가 샘플을 동결 보호합니다.
   2. 조직을 최적 절단 온도(OCT) 화합물에 삽입하고 OCT가 굳을 때까지 -20°C에 놓습니다.
   3. 조직을 포함하는 OCT 블록을 저온 유지 장치로 옮기고, 저온 유지 장치의 두께 다이얼을 12μm로 설정하고, 12μm 두께의 동결 절편을 잘라 수집합니다.
   4. 저온 유지 장치에서 수집된 조직 절편을 65°C에서 핫 플레이트에서 20분 동안 가열합니다. 1x PBS에서 각각 3분씩 10회 섹션을 세척합니다. 조직 절편을 3% 과산화수소로 10분 동안 배양하여 내인성 과산화효소를 제거합니다. 섹션을 3번 더 씻으십시오. 블로킹 버퍼(소 혈청 알부민(BSA) 3%, 비이온 세제 0.3%, 염소 혈청 2%, 아지드화나트륨 0.1% 1x PBS)로 실온에서 1시간 이상 조직을 차단합니다.
   5. 차단 완충액을 백혈구의 경우 CD45, T 세포의 경우 CD3, B 세포의 경우 B220, 대식세포의 경우 CD11b, 호중구의 경우 Ly6G와 같은 면역 세포 유형별 1차 항체를 포함하는 용액으로 교체합니다. 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
   6. 흡인에 의해 조직 절편에서 1차 항체를 제거합니다. 1x PBS로 각 10분씩 3회 섹션을 세척합니다. 비오틴화된 2차 항체로 절편을 배양한 후 실온에서 streptavidin-HRP 복합체를 사용하여 배양합니다.
   7. 3,3'-디아미노벤지딘(DAB) 용액으로 절편을 배양하여 연한 갈색 또는 짙은 갈색을 나타내고 면역 반응성 세포를 시각화합니다.
   8. 헤마톡실린과 0.3%(v/v) 희석된 암모니아로 단면을 대조염색합니다. 현미경으로 10X 배율로 명시야 이미지를 촬영합니다.
   9. 이미지 처리 프로그램을 사용하여 2개의 마스크를 설정하여 상피와 lamina propria(상피 아래) 모두에서 표시된 면역 세포의 집단을 식별하고 정량화합니다. 컬러 큐브 기반 기능의 첫 번째 마스크를 사용하여 색상 감지 임계값을 설정하고 색상이 지정된 DAB 반응 영역을 측정합니다. 두 번째 마스크를 사용하여 검사된 섹션에서 상피 및 laminar propria의 총 면적을 결정합니다. 면역반응성 세포 집단을 검사된 조직의 전체 면적에 대한 침투된 세포의 염색 면적의 비율로 발현합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
항체
CD45	BD 바이오사이언스	550539
CD3	BD 바이오사이언스	555273
나220	BD 바이오사이언스	550286
CD11b	BD 바이오사이언스	550282
라이6G	BD 바이오사이언스	551459
시약
덱스트란 황산염 나트륨염(DSS)	MP 바이오메디컬	2160110
스트렙타비딘-HRP 복합체	BD 파밍겐	551011
인산염 완충 식염수(PBS)	(주)상곤바이오텍	B548117
BD 10ml 주사기	BD 바이오사이언스	309604
기기 및 장비
저울
가위
집게
염색 용기
소프트웨어
IMAG-PRO 플러스	미디어 사이버네틱스, Inc.