담배 제품 제제에 노출된 말초 혈액 단핵 세포에 의한 K562 세포 사멸

초록

출처: Arimilli, S. et al., 가연성 담배 제품 제제의 세포 독성 및 면역 억제를 평가하는 방법. J. Vis. 특급. (2015년)

이 비디오에서는 가연성 담배 제품 제제인 전체 연기 조절 매체가 효과기 말초 혈액 단핵 세포에 의한 K562 세포 사멸에 미치는 영향을 연구합니다.

프로토콜

1. K562 살해 분석

참고: K562 세포는 분석 전에 80% 합류점에 도달할 때까지 RPMI 완전 배지로 37°C 및 5% CO₂에서 배양해야 합니다.

1. 바이알에 18μl의 DMSO를 첨가하여 5mM 카르복시플루오레세인 숙시니미딜 에스테르(CFSE) 원액을 준비합니다.
2. RPMI 완전 배지를 사용하여 96웰 플레이트에서 WS-CM 또는 니코틴을 총 부피 100μl/웰로 희석하여 각 웰에 대해 원하는 등니코틴 단위 또는 니코틴 농도를 달성합니다.
   주의: 니코틴은 독성이 강하고 환경적으로 위험합니다.
3. 100μl의 PBMC를 1.5 x 10⁶ cells/well의 농도로 RPMI 완전 배지에 추가합니다. WS-CM 또는 니코틴이 있는 세포의 총 부피는 200μl/well입니다.
4. 플레이트를 덮고 37°C 및 5% CO₂에서 3시간 동안 배양합니다.
5. DPBS 10ml를 넣고 400 x g의 RT에서 8분 동안 원심분리기를 추가하여 K562 셀을 세척합니다.
6. 10ml의 DPBS로 세포를 재현탁하고 K562 세포를 계수합니다.
7. 1ml의 DPBS에 1μl의 CFSE 원액을 첨가하여 CFSE 작업 용액을 준비합니다.
8. 1 - 2 x 10⁷ 세포를 포함하는 K562 세포 현탁액 1ml에 CFSE 작업 용액 1ml를 추가합니다. RT에서 2분 동안 정확하게 소용돌이치고 배양합니다.
9. 즉시 200μl의 FBS를 첨가합니다. RT에서 2분 동안 정확하게 소용돌이치고 배양합니다.
10. RPMI 완전 배지 10ml를 추가하고 RT에서 8분 동안 400 x g에서 튜브를 원심분리합니다.
11. RPMI 상등액을 제거하고, 펠릿을 부수고, 10ml의 RPMI 완전 배지로 세포를 재현탁하고, CFSE 표지된 K562 세포를 계수합니다.
12. RT에서 300 x g에서 3분 동안 플레이트를 원심분리하여 PBMC를 세척합니다. 액체를 디캔팅하여 상층액을 흡입합니다. 덮개를 교체하고 플레이트 바닥을 와류로 만듭니다. 200μl의 RPMI 완전 배지를 추가하고 세척 단계를 한 번 더 반복합니다.
13. PBMC 플레이트의 각 샘플 웰에 1:15(100,000 K562s:1.5 x 10⁶ PBMC)의 비율로 CFSE 표지 K562 세포를 추가하고 37°C 및 5% CO₂에서 5시간 동안 추가로 배양합니다.
14. RT에서 300 x g에서 3분 동안 원심분리하여 세포 혼합물을 세척합니다.액체를 버려 상층액을 흡입합니다. 덮개를 놓고 접시 바닥을 와류로 만듭니다.
15. 200μl의 러닝 버퍼를 추가하고 14단계에서 설명한 세척 단계를 한 번 더 반복합니다.
16. 95μl의 러닝 버퍼와 5μl의 7AAD를 각 웰에 추가하여 총 부피 100μl/well을 만듭니다. RT에서 15분 동안 어둠 속에서 플레이트를 배양합니다.
17. 각 well에 100μl의 running buffer를 추가하고 플레이트의 각 well에서 cluster tube로 전체 부피의 세포 현탁액을 전달하고 유세포 분석기에서 샘플을 획득합니다.
18. 유세포 분석 소프트웨어를 사용하여 7AAD 양성 및 CFSE 양성 세포의 비율을 측정합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
12 X 75 튜브	BD 팔콘	352058
15ml 원뿔형 튜브	코 닝	제430790
2 mL 마이크로튜브	액시겐	MCT-150-C-S
50ml 원뿔형 튜브	코 닝	430828
500ml 병	코 닝	430282
7AAD	BD 파밍겐	559925
96웰 플랫 바텀 플레이트	테르모 눙	439454
96웰 원형 바닥 플레이트	BD 팔콘	353077
세포 배양 후드	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	1300 시리즈 A2
원심 분리기	에펜도르프	58110R
증권 시세	분자 프로브 Life Technologies	C34554
클러스터 튜브	코 닝	4401	삼키면 유해함, 발암물질
DMSO (디메틸 설폭사이드)	시그마-알드리치	D8418
디피에스	론자	17-512층
FBS(증권 시세	시그마-알드리치	F2442
필터 유닛	날진	제156-4020
유세포 분석기	BD 바이오사이언스	FACS 칸토 II	Ex 405 nm 및 Em785 nm에서 8가지 색상.
유세포 분석기	BD 바이오사이언스	FACS 칼리버	Ex 495 nm 및 Em 785 nm에서 4가지 색상.
유세포 분석 소프트웨어	트리 스타	플로우조
니코틴	시그마-알드리치	N3876	급성 독성, 환경 유해
파라필름	베미스	"엠"
파라포름알데히드	시그마-알드리치	P6148	인화성, 피부 자극성
펜/연쇄상 구균	Gibco Life 기술	15140-122
RPMI 1640	Gibco Life 기술	11875-093
실행 중인 버퍼	MACS 러닝 버퍼, Miltenyi Biotech	Tel.: 130-091-221
이송 피펫	피셔 사이언티픽	Tel.: 13-711-20
트리스 베이스	시그마-알드리치	T1503

호 크 ) 표시기 건 표시기 호 (영문) 년 년 년