박테리아 응집체에 대한 항균 처리를 연구하기 위한 In vitro 기술

초록

출처: Gannon, A. D., et al. 녹농균 감염 모델의 실시간 평가를 위한 도구입니다. J. Vis. 특급 (2021).

이 비디오는 녹농균(Pa) 응집체에 대한 항균 처리의 영향을 연구하기 위한 시험관 내 기술을 보여줍니다. 형광 표지된 Pa 세포는 감염 중 성장 패턴을 모방하는 응집체로 성장합니다. 치사량 이하의 항생제 콜리스틴 농도로 응집체에 이의를 제기하면 형광 현미경을 통해 박테리아-항생제 상호 작용에 대한 실시간 평가가 수행됩니다.

프로토콜

1. 합성 낭포성 섬유증 배지(SCFM2)를 제조합니다.

참고: SCFM2 준비는 아래에 설명된 세 가지 주요 단계로 구성됩니다(그림 1).

1. 돼지 뮤신의 살균
   1. SCFM2에서 5mg/mL의 최종 농도로 멸균 뮤신을 준비합니다. 예를 들어, SCFM2 5mL 용량의 경우 멸균 페트리 접시에 25mg의 II형 뮤신을 넣고 자외선(UV) 살균기에 4시간 동안 넣고 매시간 부드럽게 저어줍니다.
   2. 4시간 후, UV 처리된 뮤신을 멸균 조건에서 오토클레이브 처리된 1.7mL 튜브로 옮기고 -20°C에서 보관합니다.
   3. 완전한 멸균을 확인하려면 물 또는 Luria-Bertani(LB) 육수와 같은 멸균 액체에 점액 샘플을 용해하고 현미경으로 관찰합니다.
      메모: 멸균된 뮤신은 -20°C에서 최대 6개월 동안 보관할 수 있습니다.
2. 완충된 염기의 준비
   1. 표 1에 열거된 바와 같이 탈이온수에 중량별로 적당량을 첨가하여 소금 및 아미노산 원액을 준비한다. 0.22μm 필터를 사용하여 모든 원액을 필터 멸균하고 호일로 싸서 광 분해를 방지하고 4°C에서 최대 한 달 동안 보관합니다.
   2. 190mL의 탈이온수를 표 1에 나열된 부피의 아미노산 및 염 원료 용액과 결합하여 완충된 염기를 준비합니다. 용액을 pH 6.8로 조정하고 최종 부피 250mL로 높입니다. 0.22μm 필터를 사용하여 필터 멸균하고 4°C에서 최대 30일 동안 보관합니다.
   3. 실험 전날 저녁에 원하는 양의 완충 염기를 유리 배양 플라스크에 분취하고 뮤신(1.1.1단계에서 설명한 대로 5mg/mL)과 정제된 연어 정자 DNA(0.6mg/mL)를 추가합니다. 부드럽게 저어주고 호일로 싸서 4°C에서 하룻밤 동안 그대로 두어 점액과 DNA가 용액에 용해되도록 합니다.
      메모: 연어 정자 DNA 분취액은 얼음 위에서 해동하고 와류로 처리한 다음 완충된 염기와 점액에 첨가해야 합니다. 트립토판, 아스파라긴 및 티로신 원액은 탈이온수 대신 NaOH 용액(농도는 표 1 참조)으로 준비해야 합니다. 완충된 베이스와 모든 원액을 호일로 싸서 빛 노출로부터 보호하십시오. 대부분의 재고는 최대 한 달 동안 안정적입니다. 변색된 스톡은 사용해서는 안 되며 사용하기 전에 교체해야 합니다.
3. 보충 재고의 추가
   1. 실험 당일, 표 2에 나열된 stocks를 mucin 및 DNA.
      를 포함하는 완충된 염기에 추가합니다. 메모: 실험 당일에 새로운 FeSO₄ 용액을 준비하되 다른 모든 재고는 미리 만들어 4 °C에서 30 일 동안 보관할 수 있습니다. 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)에는 클로로포름이 포함되어 있습니다. 취급할 때는 주의하고 화기 근처에서 사용하지 마십시오. DOPC를 첨가한 후 SCFM2를 37°C에서 진탕(250rpm)과 함께 최소 20분(5mL 배양의 경우) 동안 배양합니다. 이 잠복기를 통해 DOPC의 클로로포름이 증발할 수 있습니다. 플라스크는 밀폐되어서는 안 됩니다. 대신 플라스크 입구를 호일로 느슨하게 덮으십시오.

2. 박테리아 응집체의 항생제 내성에 대한 실시간 평가

1. 하룻밤 배양 준비
   1. 실험 전날 저녁에 항생제(카르베니실린 300μg/mL)가 함유된 LB 한천 플레이트에서 Pa PAO1-pMRP9-113 콜로니 여러 개를 LB 육수 5mL에 접종합니다. 37°C에서 250rpm으로 교반하면서 밤새 성장합니다.
      메모: 필요한 플라스미드(여기서는 녹색 형광 단백질(GFP) 발현 플라스미드, pMRP9-1)를 선택하는 데 필요한 항생제를 추가하여 하룻밤 동안 배양물을 성장시킵니다. SCFM2를 접종하기 전에 Pa 세포를 세척해야 합니다. LB는 야간 배양을 위해 다른 풍부한 실험실 배지로 대체될 수 있습니다. 모든 세균 분리물은 이 프로토콜 전반에 걸쳐 적절한 BSL-2 지침을 사용하여 처리해야 합니다.
2. SCFM2 접종
   1. 실험 당일, 500μL를 신선한 LB 육수 5mL에 접종하여 Pa 1:10(배양: 액체 매체)의 야간 배양을 역희석합니다. 250rpm에서 교반하면서 37°C에서 로그 단계(60-90분)까지 세포를 성장시킵니다.
   2. 10,000 × g에서 5분 동안 원심분리 로그 상 배양. 상층액을 제거하고 필터 멸균 인산염 완충 식염수 3mL(PBS, pH 7.0)에 재현탁하여 세포를 세척합니다. 두 번 반복하고 최종 부피 1mL의 PBS로 펠릿을 재현탁합니다.
   3. 600nm(OD600)에서 분광광도계를 사용하여 세척된 세포의 흡광도를 측정하고 5mL의 SCFM2에서 0.05의 OD600 시작에 필요한 배양량을 계산합니다. Pa를 SCFM2에 접종하고 부드럽게 와류를 일으켜 세포를 전체에 분포시킵니다. 접종된 SCFM2 1mL를 4웰, 유리 바닥, 광학 접시의 각 챔버에 피펫팅하고 37°C에서 4시간 동안 정적으로 배양합니다.
      메모: Pa 배양의 배가 시간은 균주와 산소의 가용성에 따라 달라집니다. SCFM2에서 여기에 설명된 조건에서 Pa의 배가 시간은 ~1.4시간입니다.

3. 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경(CLSM)을 사용한 항생제 치료 중 응집체 시각화

참고: 이 섹션에서는 SCFM2에서 Pa 응집체의 이미징을 위한 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경 및 이미지 캡처 소프트웨어의 사용에 대해 설명합니다. 목표는 항생제 처리 후 남아있는(내성) 박테리아 바이오매스를 관찰하고 특성화하는 것입니다. 설명된 단계는 다른 컨포칼 현미경에서도 성공적으로 수행할 수 있지만, 구체적인 지침은 기기 사용 설명서를 참조해야 합니다.

1. 주변 온도를 37°C로 유지하기 위해 현미경 스테이지에 장착된 가열된 챔버 또는 가열된 마이크로플레이트를 사용하여 Pa 배양. 실험 시작 최소 2시간 전에 배양 모듈을 시작하여 모든 장치가 원하는 온도에 도달할 수 있도록 하고 데이터 수집 중 추가 팽창 및 이동을 줄입니다.
2. 4시간 후, Pa 세포를 포함하는 SCFM2 배양물을 가열된 현미경 스테이지로 옮깁니다. 4개의 웰 중 3웰을 항생제 치료를 위한 기술적 복제물로 지정하고, 4번째 웰은 항생제를 투여하지 않고 SCFM2에 Pa 세포만 포함하는 무처리 대조군으로 간주합니다. 형광 리포터를 여기하기 전에 Locate 탭 내에서 명시야 현미경을 사용하여 응집체를 식별합니다. 각 웰 내에서 이미징을 위한 영역을 정의하고 이미징 소프트웨어의 위치 모듈을 사용하여 해당 위치(x-y-z 좌표)를 저장합니다.
3. 63x 오일 이멀젼 대물렌즈를 사용하여 여기 파장이 488nm이고 방출 파장이 509nm인 SCFM2에서 GFP 발현 플라스미드 pMRP9-1을 포함하는 Pa 배양을 시각화합니다. Acquisition 모듈 내의 z-stack 옵션을 사용하여 1μm 간격(총 60개 슬라이스)으로 이미지를 촬영합니다. Line-averaging 모듈을 사용하여 60μm z-stack 이미지(1,093.5mm3)의 총 부피 내에서 GFP 채널의 배경 형광을 줄일 수 있습니다. 이미지 분석을 위한 배경 형광을 결정하기 위해 동일한 설정을 사용하여 접종되지 않은 SCFM2의 제어 이미지를 촬영합니다.
   메모: 이미지는 커버슬립 바닥에서 60μm 떨어진 512픽셀 x 512픽셀(0.26μm x 0.26μm 픽셀) 8비트 z-스택 이미지를 생성하여 획득합니다.
4. 이미징 소프트웨어 내의 시계열 옵션을 사용하여 18시간 동안 15분 간격으로 각 위치(웰)에서 60개의 슬라이스를 캡처합니다. 소프트웨어 내에서 명확한 초점 전략을 사용하여 각 위치에 대한 초점면을 저장하며, 이 초점면은 실험 전반에 걸쳐 각 시점으로 돌아갑니다.
5. 총 4.5시간의 배양 후, 항생제를 추가하기 전에 4개의 웰 각각에 있는 응집된 바이오매스를 결정하기 위해 위의 설정을 사용하여 각 위치를 이미지
화합니다.
6. 총 배양 6시간 후, 각 복제에 최소 억제 농도(MIC)보다 2배 낮은 항생제를 추가합니다. 공기-액체 계면 바로 아래에 있는 웰 중앙으로 직접 부드럽게 피펫팅합니다. 가열된 공초점 챔버에서 모든 배양을 유지하십시오.
   메모: 여기에서는 140μg/mL 농도의 콜리스틴 설페이트를 사용했습니다.
7. 이미징 프로그램 내에서 실험 시작 옵션을 클릭하여 항생제 치료 후 이미징을 시작합니다.
   메모: 사용되는 항생제 농도는 항생제, Pa 분리물, 사용자가 사멸 또는 내성 효과를 검사하기를 원하는지 여부에 따라 다릅니다. 이 실험은 1회 투여를 사용합니다. 필요한 경우 배양을 방해하지 않고 추가 용량을 추가할 수 있습니다.

4. Pa 응집체의 Propidium iodide 염색

참고: Propidium iodide(PI)는 일반적으로 배양에서 생존할 수 없는(죽은) 박테리아 세포를 식별하기 위한 염색 시약으로 사용됩니다. 여기서, 섹션 3에서 적용된 항생제 처리에 민감한 응집체를 식별하는 데 사용됩니다. 이 프로토콜 전반에 걸쳐 Pa 세포에서 GFP의 발현 및 검출은 세포 생존력의 주요 프록시로 사용됩니다. 이 마지막 단계를 통해 컨포칼 이미징을 한 번 더 사용하여 서로 관련된 살아있는/죽은 응집체의 공간적 위치를 식별할 수 있습니다. 또한, 응집체는 섹션 3에서 추가 다운스트림 세포 분류를 위해 live/dead로 식별됩니다.

1. 18시간 후, SCFM2 배양물을 포함하는 4개의 챔버가 있는 광학 바닥 접시의 각 웰에 PI를 추가합니다. PI 부피 및 배양 시간(예: 배양 mL당 ~2μL, ~20-30분)에 대한 제조업체의 지침을 따릅니다.

5. FACS(Fluorescence-activated cell sorting) 접근법을 사용하여 응집체에서 살아있는 세포 분리

참고: FACS는 형광 태그가 지정된 표현형에 따라 세포 그룹을 분류하고 분리하는 강력한 플랫폼을 제공합니다. 여기서 FACS는 생존 불가능한 응집체에서 살아있는(항생제 내성) 응집체를 분리하는 데 사용됩니다.

1. 프로피듐 요오드화물로 염색한 후 배양에서 배양물을 제거하고 37°C를 유지하기 위해 절연 용기에 담긴 FACS 기기로 옮깁니다.
2. Pa 응집체를 포함하는 SCFM2 분취량 1mL를 가장 낮은 유속으로 실행합니다.
   메모: 각 부분 표본에는 ~15,000개의 응집체가 포함됩니다.
3. GFP를 검출하려면 488nm 레이저로 셀을 비추고 530/30nm에서 형광 신호 높이를 기록합니다. 561nm 레이저로 여기(excitation)에 의한 PI 염색을 시각화하고 610/20nm에서 형광 신호 높이를 기록합니다. 70-u 노즐을 사용하여 정렬을 수행합니다.
   메모: 정렬된 집계는 사용자의 응용 프로그램에 따라 여러 가지 방법으로 풀링할 수 있습니다. 이 경우 FACS를 사용하여 다운스트림 RNA 염기서열분석을 위해 생존 가능한 Pa 응집체를 분류했습니다.

표 1: 합성 낭포성 섬유증 객담 배지, SCFM2의 완충 염기에 필요한 염, 아미노산, DNA 및 뮤신 스톡의 준비.

호 개 호 호 호 호 분 분 분 호 호 호 년 호 호 호 호 표시기 호 . 호 . . 년 호 호 호

화학	재고 농도 (M)	최종 농도 (mM)	노트
나H2PO4	0.2	1.3
나2HPO4	0.2	1.25
3 번	1	0.35
케이2그래서4	0.25	0.27
뉴햄프셔4CL		2.28	버퍼링된 베이스에 솔리드를 직접 추가
케이클		14.94	버퍼링된 베이스에 솔리드를 직접 추가
염화나트륨		51.85	버퍼링된 베이스에 솔리드를 직접 추가
걸레		10	버퍼링된 베이스에 솔리드를 직접 추가
세르	0.1	1.45
글루 HCl	0.1	1.55
프로	0.1	1.66
글리	0.1	1.2
알라모	0.1	1.78
발	0.1	1.12
만난	0.1	0.63
일	0.1	1.12
레우	0.1	1.61
오른 HCl	0.1	0.68
리스 HCl	0.1	2.13
아르그 HCl	0.1	0.31
증권 시세	0.1	0.01	0.2 m NaOH에서 준비됩니다
아스프	0.1	0.83	0.5 m NaOH에서 준비됩니다
티르	0.1	0.8	1.0 m NaOH에서 준비됩니다
목	0.1	1.07
사이스 HCl	0.1	0.16
페	0.1	0.53
그의 HCl H2O	0.1	0.52
연어 정자 DNA		0.6 mg/mL
돼지 뮤신		5 마그네슘/nL

표 2: 합성 낭포성 섬유증 가래 배지, SCFM2의 완충 염기에 필요한 추가 스톡의 준비.

개 개 개 년 개 호 호 .

화학	재고 농도 (M)	최종 농도 (mM)	노트
포도당(D-glu2cose)	1	3
L-젖산	1	9.3	NaOH로 pH 7.0으로 조정
칼슘2*H2O	1	1.75
마그네슘2*6H2O	1	0.61
페소4*7H2O	1 밀리그램 / mL	0.0036	매일 신선하게 만들기
N-아세틸글루코사민	0.25	0.3
1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC)	25 mg/mL	100 μg/mL	첨가 후 37 °C에서 최소 20분 동안 배양합니다

결과

그림 1: SCFM2 배지의 준비 및 접종. (A) 완충된 염기는 표 1 및 표 2에 열거된 염 및 아미노산을 사용하여 제조된다. 완충된 염기는 4°C에서 최대 30일 동안 보관할 수 있지만 빛 노출로부터 보호해야 합니다. (B) 완충된 염기의 분취액에 뮤신과 DNA를 첨가하고 4°C에서 하룻밤 동안 용액에 용해시킵니다. (C) 지질 및 추가 스톡을 하룻밤 용액에 첨가하고 250rpm에서 20분 동안 교반하면서 37°C에서 배양한 다음 SFCM2에 OD₆₀₀ = 0.05에서 세척된 대수상 셀을 접종합니다. 약어: SCFM2 = 합성 낭포성 섬유증 가래 배지.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
아미노산
알라닌	Acrs 유기농	56-41-7
아르기닌 HCl	MP	1119년 34월 2
아스파라긴	Acrs 유기농	56-84-8	0.5 m NaOH에서 준비됩니다
시스틴 HCl	알파 에자르	L06328
글루타민산 HCl	Acrs 유기농	138-15-8
글리신	Acrs 유기농	56-40-6
히스티딘 HCl H2O	알파 에자르	A17627
이소류신	Acrs 유기농	73-32-5
신	알파 에자르	A12311
라이신 HCl	알파 에자르	J62099
메티오닌	Acrs 유기농	63-68-3
오르니틴 HCl	알파 에자르	A12111
페닐알라닌	Acrs 유기농	63-91-2
프롤린	알파 에자르	A10199
세린	알파 에자르	A11179
트레오닌	Acrs 유기농	72-19-5
트립토판	Acrs 유기농	73-22-3	0.2 m NaOH에서 준비됩니다
티로신	알파 에자르	A11141	1.0 m NaOH에서 준비됩니다
발린	Acrs 유기농	72-18-4
항생제
카르베니실린	알파 에자르	J6194903
주식의 날
칼슘2* 6H2O	피셔 케미컬	C79-500
포도당(D-포도당)	피셔 케미컬	50-99-7
1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC)	피셔(Avanti 극성 지질)	4235-95-4	클로로포름을 증발시키기 위해 37 °C에서 15-20 분간 흔듭니다
페소4 * 7H2O	Acrs 유기농	7782-63-0 (영문	이 재고는 1mg/mL와 같으며 신선하게 만들어야 합니다.
L-젖산	알파 에자르	엘13242	NaOH를 사용하여 pH 재고를 7로
마그네슘2 * 6H2O	Acrs 유기농	7791-18-6
N-아세틸글루코사민	티씨아이	A0092
준비된 고형물
돼지 뮤신	시그마	M1778-100지	자외선 살균
연어, 정자 DNA	인비트로젠	제15632-011
얼룩
프로피듐 요오드화물	알파 에자르	J66764MC
소금
케이2그래서4	알파 에자르	A13975
케이클	알파 에자르	J64189	버퍼링된 베이스에 솔리드를 직접 추가
3 번	Acrs 유기농	7757-79-1
걸레	알파 에자르	A12914	버퍼링된 베이스에 솔리드를 직접 추가
염화나트륨	피셔 케미컬	시즌 271-500	버퍼링된 베이스에 솔리드를 직접 추가
나2HPO4	증권 시세	S23100-500.0
나H2PO4	증권 시세	S23120-500.0
뉴햄프셔4CL	Acrs 유기농	12125-02-9	버퍼링된 베이스에 솔리드를 직접 추가
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피펫 팁(p1000)	올림푸스 플라스틱	23-165RL
혈청학적 피펫(5mL)	올림푸스 플라스틱	12-102
혈청학적 피펫(25mL)	올림푸스 플라스틱	12-106
혈청학적 피펫(50mL)	올림푸스 플라스틱	12-107
초순수(RNAse/DNAse 없음), 나노 순수	제네시 사이언티픽	18-194	표 1에서 용액 제조에 사용되는 나노 순수
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주사기(50mL)	BD (영어)	309653
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