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동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. 세포의 감염 준비
- 125 mL 플라스크와 37 °C/5% CO2로 유지되는 조직 배양 인큐베이터를 사용하여 10% 태아 송아지 혈청(이하 DMEM/FCS)이 보충된 DMEM 조직 배양 배지에서 마우스 대식세포 유사 세포주 RAW 264.7을 증식시킵니다.
- 감염 전날에는 세포 스크레이퍼를 사용하여 팽창 플라스크에서 세포를 제거하고 15mL 나사 캡 원뿔형 튜브에 수집합니다. 800 x g에서 10분 동안 세포를 원심분리하고, 상등액을 디캔트하고, 1mL의 DMEM/FCS(항생제 없음)에 세포 펠렛을 현탁시키고, 혈구계 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 역가를 측정합니다.
- 역가를 2 x 106 cells/mL로 조정하고 48웰 조직 배양 접시의 웰에 0.10mL(2 x 105 cells)를 추가합니다. 세포 현탁액이 웰의 전체 표면을 덮고 있는지 확인합니다.
- 컨디셔닝된 배지의 나중에 공급을 위해 추가 웰에 있는 플레이트 셀. 또한 0.10mL의 DMEM/FCS를 3개의 추가 웰에 배치하여 '무세포 대조군' 역할을 합니다.
- 조직 배양 인큐베이터에서 37 °C/5% CO2에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음날, 박테리아 접종이 준비되고 사용할 준비가 될 때까지 인큐베이터에서 제거하지 마십시오.
2. 감염을 위한 리스테리아 모노사이토제네스(Lm) 준비
- 갓 줄무늬가 있는 Lm 한천 플레이트(<2일)에서 단일 콜로니로 뇌-심장 주입(BHI) 2mL를 접종하고 37°C에서 분당 130회전으로 흔들면서 밤새 배양합니다.
- 다음날, 0.10mL의 예열된 BHI에 2mL의 야간 배양을 추가하고 광학 밀도(OD600)가 0.4에서 0.6 사이가 될 때까지 진탕하면서 37°C에서 계속 배양합니다.
- 경험적으로 도출된 변환 공식을 사용하여 근사 박테리아 역가를 결정합니다. 우리 실험실에서 BHI에서 기하급수적으로 증가하는 Lm 배양은 약 1.3 x 109 집락 형성 단위(CFU)/OD600입니다. 박테리아 배양액이 실온에 노출되는 시간을 최소화합니다.
- 감염 직전에 예열된 DMEM/FCS를 희석제로 사용하여 역가를 5 x 107 CFU/mL로 조정합니다.
3. 감염
- 빠르고 정확하게 작업하여 접시를 약간 기울이고 피펫 팁을 위에 있는 매체에 조심스럽게 배치하여 갓 준비된 Lm 접종물(위의 2.4단계)의 20μL(1 x 106 CFU, 감염의 다양성, MOI = 5)를 웰에 추가합니다.
알림: 피펫 끝으로 우물 벽을 만지지 마십시오.
- 완전한 혼합을 보장하기 위해 각 웰의 내용물을 부드럽게 피펫으로 분사하십시오. 플레이트를 흔들거나 크게 기울이면 웰 벽에 Lm이 퍼질 수 있습니다. 세포 배양 접시를 37°C/5% CO2 인큐베이터에 다시 넣습니다.
- 감염되지 않은 웰의 컨디셔닝 배지를 희석제로 사용하여 10μg/mL 겐타마이신 용액을 준비합니다.
- 감염 후 30분(mpi)에 겐타마이신 용액 30μL(최종 농도 2.5μg/mL)를 조심스럽게 첨가하고 웰의 내용물을 이전과 같이 부드럽게 피펫팅한 다음 세포 배양 접시를 37°C/5% CO2 인큐베이터로 되돌립니다.
- 60mpi에서 CFU 분석(60mpi 시점) 또는 FCM 분석(각각 섹션 4 및 5에 설명된 대로)에 적합한 웰을 수확합니다.
- 잔여 웰의 경우, 그 후 여러 차례에 걸쳐 이전과 같이 세포를 수확하거나 Lm 출현 분석의 경우 웰에서 배지를 완전히 제거하고 150μL의 겐타마이신이 없는 컨디셔닝 배지로 교체합니다.
4. CFU 분석에 의한 세포내 및 응급 Lm의 샘플링 처리 및 분석
- 수확하려면 접시를 약간 기울이고 우물에서 전체 매체를 조심스럽게 제거하십시오. 웰에 0.50mL의 증류수 멸균수(dsH2O)를 추가합니다. 30초 후 생성된 물 용해물(100)을 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 10초 동안 격렬하게 와류합니다.
- 450 μL의 dsH2O에 4.5 μL 또는 50 μL의 물 용해물을 첨가하여 10-1 및 10-2 희석액을 준비하고 철저한 혼합을 보장하기 위해 잠시 와류를 준비합니다.
- 100, 10-1 및/또는 10-2 샘플 50μL를 용원 육종(LB) 한천 플레이트에 펴 바릅니다.
- 응급 Lm을 분석하려면(위의 3.6단계), 오버레이 배지 10 μL를 제거하고 두 개의 5 μL 분취량으로 나눕니다: 한 부분 표본에는 5 μL의 DMEM/FCS를 첨가하고 두 번째 부분 표본에는 5 μg/mL 겐타마이신을 함유한 5 μL의 DMEM/FCS를 추가합니다. 후자의 대조군은 후속 CFU 분석에서 세포외 Lm(겐타마이신 민감성)과 세포내 Lm(겐타마이신 내성)을 구별합니다.
- 실온에서 5분 후 90μL의 dsH2O를 추가하고 10초 동안 격렬하게 소용돌이치며 LB 한천 플레이트에 50μL를 펴 바릅니다.
- 37 °C에서 2일 동안 배양한 후 LB 한천 플레이트의 Lm 콜로니를 열거합니다.